银耳密码子偏好性分析及启动子克隆

论文摘要

银耳是一种著名的食药用真菌,其菌种生产是无性繁殖,作为生物反应器具有与原核生物、酵母菌一样后代稳定的优点。另外还具有真核生物翻译后加工修饰系统,因此能够较好的表达真核基因。为了提高外源基因在银耳中的表达水平,提供将银耳生物反应器推广到实际生产中的理论依据,本研究从以下两方面开展工作：一是利用先进的生物信息学技术对银耳的密码子偏好性进行分析,以银耳的最优密码子改造外源基因使其能够更好地适应银耳宿主环境实现高效表达;二是采用TAIL-PCR技术克隆银耳的启动子,以提高外源基因的银耳表达效率。具体研究成果如下：1、银耳芽孢cDNA文库的构建以银耳Tr21菌株的芽孢为材料,利用RNAiso Reagent试剂盒地提取银耳芽孢总RNA,Oligotex mRNA Purification Kit精制得到mRNA,用cDNA Synthesis Kit将mRNA反转录合成双链cDNA。通过CHROMA SPIN+TE-1000去短片段的cDNA与载体pBluescript Ⅱ SK（+）连接,电转化（1.5KV,200Ω,25μF）导入宿主细胞大肠杆菌DH10B中,构建了银耳芽孢cDNA文库。利用T7和T3两个引物对随机挑取的16个单菌落进行PCR扩增。结果表明：银耳芽孢cDNA文库的重组率为100%,平均插入片段约为1300bp,文库的库容约为7.5×106 cfu,达到建库要求。2、银耳密码子偏好性分析通过密码子在线分析软件CodonW和CUSP对测序获得的80条蛋白编码序歹（Coding DNA Sequence, CDS）进行分析,统计银耳密码子同义密码子相对使用度（Relative Synonymous Codon Usage, RSCU）和同义密码子相对使用频率（Relative Frequency of Synonymous Codon, RFSC）,确定了银耳蛋白编码基因的18个高频密码子。分析结果还显示,银耳基因的G+C含量为59.02%,其中密码子第三位碱基的G+C含量高达69.72%,说明银耳基因偏爱以G或C结尾的密码子。运用高表达优越密码子分析法确定17个银耳高表达优越密码子,利用CodonW软件统计高、低表达两样本组的总体RSCU值,结果表明高表达样本组的密码子偏好程度高于低表达样本组,推测基因的表达水平是影响银耳密码子偏好程度的一个重要因素。3、银耳启动子的克隆及验证根据密码子偏好性分析结果和银耳芽孢表达谱测序结果,筛选了三个高表达基因（实验编号分别为E02、C02、G06）,在这三个基因的cDNA序列的基础上设计引物,利用热不对称PCR （Thermal Asymmetric Interlaced PCR, TAIL-PCR）技术克隆启动子,构建了以潮霉素转移酶基因hpt为选择标记基因的表达载体（实验编号分别为pBHg-E02、 pBHg-C02、pBHg-G06）。通过冻融法将载体质粒转化到农杆菌感受态细胞中。携带有载体质粒的农杆菌与潮霉素敏感型银耳菌株Tr21-01共培养后,在含有潮霉素的选择培养基上筛选转化子。结果显示：携带有pBHg-G06载体的农杆菌侵染银耳芽孢后得到抗性菌落,经提基因组DNA和PCR验证,重组子确实包含了银耳启动子序列和基因htt,即G06启动子序列和基因htt成功地插入到银耳基因组中。结果说明了实验克隆得到一个银耳启动子。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 银耳的介绍
• 1.1 银耳的分类地位及生物学特性
• 1.2 银耳的生活史
• 1.3 银耳的营养价值
• 1.4 银耳的研究进展
• 2 cDNA文库构建
• 2.1 cDNA文库的概念与意义
• 2.2 构建cDNA文库的过程
• 2.3 构建cDNA文库的方法
• 2.3.1 固相cDNA文库法
• 2.3.2 Oligo-capping法
• 2.3.3 SMART法
• 3 密码子用法偏性分析
• 3.1 密码子使用偏好性
• 3.2 密码子使用偏好性的应用
• 3.3 密码子偏好性分析方法
• 3.3.1 相对同义密码子使用度
• 3.3.2 同义密码子相对使用频率
• 3.3.3 密码子适应指数
• 3.3.4 有效密码子数
• 4 食用菌启动子的研究进展
• 4.1 启动子的特征
• 4.1.1 真核启动子的结构
• 4.1.2 增强子
• 4.2 应用于食用菌载遗传转化的启动子
• 4.3 克隆启动子的方法
• 4.3.1 启动子探针质粒载体筛选
• 4.3.2 利用PCR技术克隆启动子
• 5 食用菌遗传转化的研究
• 5.1 遗传转化方法
• 2-PEG介导的遗传转化'>5.1.1 CaCl₂-PEG介导的遗传转化
• 5.1.2 电激介导的遗传转化
• 5.1.3 基因枪遗传转化
• 5.1.4 限制性内切酶介导的遗传转化
• 5.1.5 农杆菌介导的遗传转化法
• 5.2 遗传选择标记
• 5.2.1 营养缺陷型标记
• 5.2.2 药物抗性标记
• 5.3 基因表达产物的检测
• 5.3.1 外源基因转录产物的检测
• 5.3.2 报告基因的酶法检测
• 5.3.3 免疫学检测
• 5.3.4 表达产物生物活性检测
• 6 本研究的目的与意义
• 第一章 银耳芽孢cDNA文库的建立
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 培养基
• 1.3 试剂
• 2 方法
• 2.1 Total RNA的提取
• 2.2 Poly（A）+RNA的精制
• 2.3 cDNA的合成
• 2.3.1 cDNA第一条链的合成
• 2.3.2 cDNA第二条链的合成
• 2.4 粘性末端连接
• 2.5 磷酸化
• 2.6 限制酶XhoI酶切反应
• 2.7 去除短链cDNA
• 2.8 与载体连接
• 2.9 转化到大肠杆菌感受态细胞中
• 2.10 插入片段大小的验证
• 2.11 库容的计算
• 2.12 全长cDNA的测序与分析
• 3 结果与分析
• 3.1 总RNA的提取
• 3.1.1 总RNA的均一性
• 3.1.2 总RNA的完整性
• 3.2 mRNA的纯化
• 3.3 cDNA的合成
• 3.3.1 双链cDNA的合成
• 3.3.2 短片段cDNA的去除
• 3.4 插入片段大小的验证
• 3.5 库容
• 3.6 全长cDNA序列分析
• 4 讨论
• 4.1 RNA质量
• 4.2 文库质量
• 4.3 cDNA序列分析
• 第二章 银耳密码子偏好性分析
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 银耳芽孢蛋白编码序列的获取
• 2.2 高频密码子分析法
• 2.2.1 银耳芽孢同义密码子用法分析
• 2.2.2 银耳芽孢高频密码子的确定
• 2.2.3 银耳芽孢和其他几种生物密码子偏好性比较
• 2.3 高表达密码子分析法
• 2.3.1 密码子有效数的计算
• 2.3.2 同义密码子相对使用度的计算
• 2.3.3 高表达优越密码子的确定
• 3 结果与分析
• 3.1 高频密码子分析法
• 3.1.1 高频密码子的确定
• 3.1.2 银耳与其他生物密码子偏好性比较
• 3.1.3 银耳、酿酒酵母与其他生物密码子使用频率比值的比较
• 3.2 高表达优越密码子分析法
• 3.2.1 高、低表达基因样本组的抽取
• 3.2.2 高表达优越密码子的确定
• 3.2.3 高、低表达样本组的密码子偏好性的比较
• 4 讨论
• 4.1 高频密码子分析法
• 4.2 高表达优越密码子分析法
• 第三章 银耳启动子的克隆及功能验证
• 1 材料
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 1.5 引物
• 2 方法
• 2.1 银耳高表达基因的筛选
• 2.2 银耳启动子的克隆
• 2.2.1 银耳芽孢总DNA的提取
• 2.2.2 银耳G06、C02、E02三个基因上游片段的克隆
• 2.2.3 目的片段的回收
• 2.2.4 目的片段与载体连接
• 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.6 转化子验证及测序
• 2.2.7 序列分析
• 2.3 表达载体构建
• 2.3.1 质粒提取
• 2.3.2 pBHg-E02表达载体构建
• 2.3.3 pBHg-G06表达载体构建
• 2.3.4 pBHg-C02表达载体构建
• 2.4 银耳启动子的验证
• 2.4.1 根癌农杆菌感受态细胞的制备
• 2.4.2 冻融法转化农杆菌
• 2.4.3 农杆菌菌落PCR
• 2.4.4 农杆菌介导潮霉素基因转化银耳芽孢
• 2.4.5 银耳转化子的验证
• 3 结果与分析
• 3.1 高表达量基因的筛选
• 3.2 银耳启动子的克隆
• 3.2.1 银耳芽孢总DNA的提取
• 3.2.2 银耳G06、C02、E02三个基因上游片段的克隆
• 3.2.3 序列分析
• 3.3 表达载体构建
• 3.3.1 pBHg-E02表达载体构建
• 3.3.2 pBHg-G06和pBHg-C02表达载体构建
• 3.4 银耳启动子的验证
• 3.4.1 重组质粒转化农杆菌
• 3.4.2 农杆菌菌落PCR验证
• 3.4.3 农杆菌介导潮霉素基因转化银耳芽孢
• 3.4.4 银耳转化子验证
• 4 讨论
• 4.1 高表达基因的筛选
• 4.2 银耳启动子克隆
• 4.3 启动子序列分析
• 4.4 载体构建
• 4.5 银耳启动子的验证
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢