离子注入和基因组重排提高青霉产纤维素酶能力及应用效果研究

论文摘要

纤维素是葡萄糖通过β-1,4-糖苷键结合而成的高分子聚合物,是构成植物细胞壁的主要物质之一,大量存在于农业和生活废弃物中,且短期内可再生。目前纤维素乙醇的生产是国内外研究的热点之一,以木质纤维素为原料生产的第二代燃料乙醇由于其原料广泛,价格低廉,且不存在与人争粮的问题,是一种经济、环境友好的可持续发展的燃料。在第二代生物乙醇产业中,纤维素转化为生物乙醇的主要程序包括原材料的预处理、原料的纤维素酶降解和酵母利用还原糖的发酵。其中纤维素酶的高成本,是制约纤维素乙醇商品化的一个重要因素。自然界筛选到的原始菌株直接用于工业化生产成本太高,为了得到高产纤维素酶的优良菌株,必须对原始菌株进行改造。由于木质纤维素结构复杂,纤维素酶对纤维素的降解效率较低,因此,需要对木质纤维素原料进行预处理。斜卧青霉（Penicillium Decumbens） JUA10-1是由我们实验室斜卧青霉114-2通过多轮理化复合诱变之后得到的抗葡萄糖阻遏突变株,除了具有较全的纤维素酶系外,它还可以产生大量的半纤维素酶,在降解结构复杂的木质纤维素材料方面有很好的应用前景。但其产生纤维素酶的能力仍有待于进一步提高,以降低纤维素酶生产和应用成本。由于目前对该菌株的遗传背景和纤维素酶的表达调控机制并不清楚,不能建立合理的遗传操作系统,因此无法对其进行基因工程等理性的改造。另外,JUA10-1是斜卧青霉菌株114-2经过多轮复合诱变得到的突变株,本身已经承载了较多的负向突变,如果再对其进行诱变处理,可能效果不大,而且可能会使其生长能力进一步下降,不利于其在实际生产中的应用。离子束诱变技术是近年来应用较多的一种诱变育种方法,具有突变范围广和程度高等特点,且引入的生物变异稳定。基因组重排技术可以在不了解生物遗传背景的情况下进行全基因组的重排,能够快速高效的获得表型有较大改进的菌株。本文利用离子束诱变和基因组重排技术对该菌株JUA10-1进行改造,主要获得了以下结果：（1）根据不同诱变剂量下的存活率,做出了斜卧青霉JUA10-1的N+离子束注入的诱变存活率曲线,通过曲线的拐点找出了离子束的最佳诱变剂量。（2）通过离子束注入诱变,采用纤维素双层平板初筛和摇瓶复筛的方法,筛选出纤维素酶滤纸酶活比出发菌株提高至少20%的菌株,且选育菌株的β-葡萄糖苷酶酶活也比JUA10-1有所提高。（3）建立了双亲本灭活原生质体融合方法：通过提高热灭活的温度,缩短了火活时间,有效地缩短原生质体融合的时间。（5）采用木糖渣和麦草分别作为碳源进行产酶时,融合子和诱变菌株在产酶上比出发菌株有明显优势。（6）利用选育菌株产生的纤维素酶,以热水预处理的麦草作为底物,进行同步糖化发酵生产乙醇实验,当底物浓度为10%时,最高产酒浓度达到34 g/L,转化率达到99%。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 符号说明及缩略词
• 第一章 前言
• 1.1 纤维素乙醇发展总述
• 1.2 生物乙醇的历史及发展
• 1.3 影响纤维素材料生物转化的因素
• 1.4 真菌纤维素酶及其改造
• 1.5 预处理工艺
• 1.6 生物乙醇的发酵工艺
• 1.7 本论文的研究目的与主要工作内容
• 第二章 离子束注入诱变JUA10-1筛选高产纤维素酶突变株
• 2.1 实验材料及方法
• 2.1.1 菌株、培养基和主要仪器及生化试剂
• 2.1.2 离子束诱变菌株的筛选
• 2.1.3 酶活测定
• 2.1.4 蛋白含量测定
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 离子束诱变的致死曲线
• 2.2.2 离子束诱变突变菌株的筛选
• 2.3 本章小结
• 第三章 基因组重排技术提高青霉纤维素酶产量的研究
• 3.1 实验材料及方法
• 3.1.1 菌株与培养基
• 3.1.2 常用缓冲液、主要仪器及生化试剂
• 3.1.3 基因组重排菌株的筛选
• 3.1.3.1 融合前菌丝的培养
• 3.1.3.2 原生质体的制备,鉴定和再生
• 3.1.3.3 原生质体的灭活条件研究
• 3.1.3.4 原生质体的融合
• 3.1.3.5 基因组重排及高产融合子的筛选
• 3.1.3.6 基因组的提取
• 3.1.3.7 随机扩增多态性DNA（RAPD）
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 原生质体释放的形态学观察
• 3.2.2 原生质体的最佳灭活条件
• 3.2.3 融合子的筛选
• 3.2.4 应用RAPD分析融合子与出发株的亲缘关系
• 3.3 本章小结
• 第四章 斜卧青霉在不同碳源中的产酶及粗酶液在预处理麦草中的应用
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌株及原料
• 4.1.2 培养基及培养条件
• 4.1.3 主要仪器及常用生化试剂
• 4.1.4 麦草的热水预处理
• 4.1.5 不同来源的纤维素酶粗酶液的制备
• 4.1.6 不同碳源来源的纤维素酶粗酶液对不同纤维素底物的的糖化效果研究
• 4.1.7 不同株菌产纤维素酶的粗酶液对预处理后麦草的SSF效果影响研究
• 4.1.8 分析与测定方法
• 4.1.8.1 麦草的化学成分分析
• （1） 水分的测定
• （2） 灰分含量的测定
• （3） 有机溶剂抽出物含量测定
• （4） 综纤维素含量的测定
• （5） 酸溶木素含量的测定
• （6） 酸不溶木素含量的测定
• （7） HPLC法测定单糖含量
• 4.1.8.2 酶活、葡萄糖及乙醇含量测定
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 原材料与预处理麦草的成分
• 4.2.2 不同碳源粗酶液的酶活比较
• 4.2.3 不同碳源粗酶液的糖化效率比较
• 4.2.4 以麦草为碳源粗酶液的同步糖化发酵比较
• 4.2.4.1 浓缩酶液的酶活
• 4.2.4.2 以麦草为碳源的不同种发酵酶液同步糖化发酵（SSF）比较
• 4.3 本章小结
• 全文总结及工作展望
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表