诱导小鼠成纤维细胞为多能干细胞的研究

论文摘要

诱导多能干细胞是当今的研究热点之一,该项技术在生物医学、细胞工程、组织工程和转基因动物生产等领域具有广泛的应用前景。本研究在克隆获得Sox2、Oct4、Klf4和c-Myc基因的基础上,构建逆转录病毒载体pMXs-Sox2、pMXs-Oct4、pMXs-Klf4和pMXs-cMyc并获得病毒悬液。将获得的病毒悬液感染小鼠成纤维细胞后,观察其形成细胞克隆的能力及检测细胞克隆的碱性磷酸酶活性,为进一步开展小鼠iPS的相关研究奠定基础。本研究的研究结果如下。（1）利用小鼠肝组织DNA扩增获得经PCR和酶切鉴定约在1000bp处出现特异条带的Sox2基因；利用小鼠囊胚RNA扩增获得经PCR和酶切鉴定约在1400bp处出现特异条带的Oct4基因；利用小鼠孕期19.5d皮肤组织RNA扩增获得经PCR和酶切鉴定约在1500bp处出现特异条带的Klf4基因；利用小鼠乳腺癌细胞RNA扩增获得经PCR和酶切鉴定约在1400bp处出现特异条带的c-Myc基因。对所获得的Sox2、Oct4、Klf4和c-Myc基因进行序列分析,其与GenBank中相应序列的同源性分别为100%、99.91%、99.72%和100%。（2）利用克隆获得的Sox2、Oct4、Klf4和c-Myc基因,与逆转录病毒载体pMXs构建获得经PCR、酶切和测序鉴定正确的逆转录病毒载体pMXs-Sox2、pMXs-Oct4、pMXs-Klf4和pMXs-cMyc。（3） Sox2、Oct4、Klf4和c-Myc诱导因子的病毒悬液通过细胞免疫荧光检测其具有感染能力；将其感染小鼠成纤维细胞,经常规方法传代后第3d可见到ES样克隆出现,第7d进行挑克隆传代3次后诱导细胞具有典型的小鼠ES细胞克隆形态,并且碱性磷酸酶活性检测呈现阳性的蓝紫色。综上所述,本研究运用成功克隆获得的Sox2、Oct4、Klf4和c-Myc基因与逆转录病毒载体pMXs构建相应逆转录病毒pMXs-Sox2、pMXs-Oct4、pMXs-Klf4和pMXs-cMyc,利用其诱导小鼠成纤维细胞获得与小鼠ES细胞在形态学及生物学特征中极为相似的细胞克隆,为进一步探讨哺乳动物iPS的相关研究奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 体细胞重编程
• 1.2 iPS细胞的进展与应用
• 1.2.1 iPS细胞的进展
• 1.2.2 iPS细胞的应用
• 1.3 本研究目的与意义
• 2 小鼠iPS诱导因子的克隆
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物、细胞及菌株
• 2.1.2 主要试剂与药品
• 2.1.3 溶液的配制
• 2.1.4 实验仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 小鼠iPS诱导因子的克隆
• 2.2.2 小鼠iPS诱导因子的鉴定
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 Sox2基因的克隆与序列分析
• 2.3.2 Oct4基因的克隆与序列分析
• 2.3.3 Klf4基因的克隆与序列分析
• 2.3.4 c-Myc基因的克隆与序列分析
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 3 逆转录病毒载体的构建
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验菌株
• 3.1.2 载体信息
• 3.1.3 主要试剂与药品
• 3.1.4 溶液的配制
• 3.1.5 实验仪器设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 逆转录病毒载体的构建
• 3.2.2 逆转录病毒载体的鉴定
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 逆转录病毒载体pMXs-Sox2的鉴定
• 3.3.2 逆转录病毒载体pMXs-Oct4的鉴定
• 3.3.3 逆转录病毒载体pMXs-Klf4的鉴定
• 3.3.4 逆转录病毒载体pMXs-cMyc的鉴定
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 4 小鼠成纤维细胞的iPS诱导
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验动物、细胞及质粒
• 4.1.2 主要试剂与药品
• 4.1.3 溶液的配制
• 4.1.4 实验仪器设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 逆转录病毒载体的病毒包装与检测
• 4.2.2 小鼠成纤维细胞的iPS诱导
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 小鼠成纤维细胞
• 4.3.2 病毒感染性能的检测
• 4.3.3 诱导细胞培养后的形态特征
• 4.3.4 诱导细胞传代后的形态特征
• 4.3.5 诱导细胞的碱性磷酸酶检测
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢