猪群中2009甲型H1N1流感病毒分离鉴定和HA基因点突变对小鼠致病性的研究

论文摘要

H1N1亚型猪流感病毒是猪流感（Swine influenza,SI）的重要病原之一,为正粘病毒科、A型流感病毒属,由8个分节段的基因组构成,共编码11种蛋白。H1N1亚型猪流感1918年美国最先报道,2009年一种新型甲型流感病毒引发的疫情迅速在世界范围内蔓延,引发全球人类流感大流行。2009甲型H1N1流感已突破种间屏障能感染猪、犬、雪貂等动物,相继在北美、南美和亚洲出现2009甲型H1N1猪流感疫情,发生人与猪、猪与猪之间的互相传播。因此,开展对H1N1亚型SIV的遗传演化分析和致病性研究具有重要意义。本研究对从2009年到2011年采自广西南宁、柳州、贺州、玉林、钦州、贵港和桂林等8个市发病猪群的肺组织病料2300份样品进行病毒分离。样品经常规处理后,接种9-10日龄的SPF鸡胚进行SIV的分离,共分离到9株H1亚型SIV,经HA和NA部分序列测定分析,有3株是2009甲型H1N1 流感病毒,分别命名为 A/Guangxi/1/2011（SwGX1/11）、A/Guangxi/3/2011（SwGX3/11）和 A/Guangxi/12/2011（SwGX 12/11）。对这 3 株分离毒株进行全基因序列测定,通过NCBI上的blast比较发现,3株H1N1亚型SIV与A/California/04/2009等2009年感染人的甲型H1N1流感病毒的进化关系接近,核苷酸序列同源性都在99.1%以上;3株分离株的推导氨基酸与A/California/04/2009 株相比,SwGX1/11 株有 26 个氨基酸变化,SwGX3/11株和SwGX12/11株各有16个氨基酸改变,氨基酸变化主要集中在HA和NA基因上,涉及到关键位点的有HA蛋白上225和226位点,NA蛋白上的119、295和386位点,NP蛋白上的375位点,特别是SwGX12/11株HA蛋白上226位点是Q,而225位点为G,是人甲流重症患者具有的分子特征。3株分离株在MDCK细胞上的生长良好,SwGX1/11株、SwGX3/11株和SwGX12/11株流感病毒每毫升种毒所含的TCID50分别为107.7、107.5和108.0。3株分离株以106TCID50病毒悬液50μL滴鼻攻毒BALB/c小鼠,SwGX1/11株和SwGX3/11株接毒小鼠平均体重下降最大值分别为9.13%和11.31%,SwGX12/11株在接毒的8只小鼠中有2只小鼠死亡,平均体重下降最大时为23.04%;小鼠接毒后第3天,SwGX1/11株、SwGX3/11株和SwGX12/11株在小鼠肺组织病毒TCID50/mL平均滴度分别是105.53±0.4、105.67±.29和106.2±0.35,鼻甲骨组织中病毒TCID50/mL平均滴度分别是103.83±0.42、102.73±0.44和105.73±0.64。结果表明3株甲型H1N1流感病毒都对小鼠有致病性,SwGX12/11株对小鼠致病性最强,是强毒型甲型H1N1流感病毒。为了进一步确定HA基因变化对小鼠致病力的影响,本研究选取SwGX12/11株流感病毒进行了拯救,用8质粒系统拯救出RSwGX12/11株病毒,该毒株全基因测序结果与野生型SwGX12/11株核苷酸序列同源性100%,对MDCK细胞的TCID50、鸡胚的EID50以及小鼠的致病性基本一致。在此基础上利用反向遗传技术对RSwGX12/11株的HA蛋白上225位点和226位点的氨基酸进行突变,获得了 HAmutQ226R株和HAmutG225D&Q226R株2株突变株。2株突变毒株对MDCK细胞的TCID50、鸡胚的EID50以及小鼠的致病性没有差异,但与获救亲本毒株RSwGX12/11株相比,除鸡胚的EID50没有变化外,在MDCK细胞的TCID50和小鼠的致病性差异显著,HAmutQ226R突变株和HAmutG225D＆Q226R株在MDCK细胞适应能力差,其TCID50/ml分别为104.5和103.8,而RSwGX12/11株在MDCK 细胞上的 TCID50/ml 是 107.5;HAmutQ226R 突变株和 HAmutG225D&Q226R株对小鼠的毒力也大幅度降低,两者感染小鼠的体重下降最低值分别为2.46%和2.35%,而亲本株RSwGX12/11株是24.33%,这表明HA蛋白226位上氨基酸残基的改变与H1N1流感病毒对小鼠的致病力有密切关系,当HA蛋白上226位点为精氨酸R时,HA蛋白上225位点为甘氨酸G或者为天冬氨酸D,H1N1甲型流感病毒对MDCK细胞的TCID50、鸡胚的EID50以及小鼠的致病性没有差异。本研究对广西猪群2009甲型H1N1流感病毒的流行病学、遗传进化和致病性等方面进行了系统研究,结果表明2009甲型H1N1流感病毒正在广西猪群中流行,毒株已发生了变异,毒力有增强的趋势,HA蛋白上225和226位点的氨基酸突变会大幅度改变病毒在MDCK细胞上的生长和对小鼠的致病性。研究结果为进一步开展SIV致病机制和防控技术研究提供重要的科学依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 第一章 文献总述
• 1. H1N1亚型猪流感病毒概述
• 1.1 H1N1亚型猪流感病毒的病原学特征
• 1.2 H1N1亚型猪流感病毒（Swine influenza virus）流行病学
• 1.2.1 古典型H1N1猪流感（classical swine H1N1 virues）流行病学
• 1.2.2 类禽型H1N1猪流感流行病学
• 1.2.3 类人型H1N1猪流感流行病学
• 1.3 2009甲型H1N1流感病毒流行病学
• 1.3.1 2009年甲型H1N1流感起源
• 1.3.2 2009甲型H1N1流感在我国猪群中的流行状况
• 2. 2009甲型H1N1流感病毒的致病性分子生物学基础
• 2.1 血凝素（Hemagglutinin,HA）
• 2.2 神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）
• 2.3 核蛋白（Nucleoprotein,NP）
• 2.4 基质蛋白（Matrix proteins M）
• 2.5 聚合酶
• 2.6 非结构蛋白（Nonstructural proteins,NS）
• 3. 反向遗传操作系统的研究进展
• 4. 本研究的目的和意义
• 第二章 猪群中2009 （H1N1）病毒的分离鉴定与序列分析
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 2.1 样品来源
• 2.2 主要试剂
• 2.3 主要实验仪器
• 2.4 病毒的分离
• 2.5 病毒亚型血凝抑制试验的鉴定
• 2.6 PCR鉴定病毒亚型与PCR扩增回收全基因组
• 2.7 病毒基因序列测定
• 2.8 遗传进化分析
• 3. 结果
• 3.1 病毒的分离及鉴定
• 3.2 亚型H1N1的猪流感病毒全基因测序分析
• 4. 讨论
• 4.1 流行病学调查
• 4.2 HA基因的分子生物学分析
• 4.3 遗传进化分析
• 4.4 药物敏感性分析
• 第三章 2009甲型H1N1病毒对小鼠的致病性实验
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 2.1 毒株
• 2.2 细胞
• 2.3 实验动物
• 2.4 试剂
• 2.5 实验器材
• 2.6 病毒在MDCK细胞上培养增殖
• 50)测定'>2.7 组织半数感染量(50% Tissue culture infections dose,TCID₅₀)测定
• 2.8 感染实验
• 2.9 病毒滴定
• 2.10 整理数据
• 3. 结果
• 50)/mL结果'>3.1 3株2009甲型H1N1流感病毒细胞半数感染量(TCID₅₀)/mL结果
• 3.2 鼻腔感染BALB/c小鼠存活及体重变化结果
• 3.3 3株2009甲型H1N1流感病毒鼻腔感染小鼠脏器病毒分离结果
• 3.4 3株2009甲型H1N1流感病毒对小鼠感染性划分
• 4. 讨论
• 第四章 2009（H1N1）流感病毒A/Swine/Guangxi/12/2011株血凝素点突变拯救毒株对小鼠致病性的研究
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 2.1 毒株
• 2.2 鸡胚及动物
• 2.3 主要试剂、仪器设备
• 2.4 293T细胞
• 2.5 pBD载体
• 2.6 重组质粒的构建
• 2.7 病毒拯救
• 2.8 HA基因定点突变
• 2.9 定点突变毒株的拯救
• 2.10 获救的亲本重组以及点突变病毒对BALB/c小鼠的致病性试验
• 3. 结果
• 3.1 救获亲本毒株结果
• 3.2 HA基因定点突变结果
• 3.3 救获病毒对BALB/c小鼠的致病性结果
• 4. 讨论
• 4.1 反向遗传操作技术的应用
• 4.2 流感病毒基因突变对致病性的影响
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间论文发表及科研成果情况