基于金纳米颗粒构建新型生物传感器的研究

论文摘要

生物传感器是一种利用生物分子（如酶、抗体、核酸、微生物及细胞等）作为识别元件来对生物活性物质进行分析检测的装置。它具有优良的特异性和灵敏性,在医药卫生、生物工程、环境保护等诸多领域都有广泛的应用。而金纳米颗粒由于具有多种传统材料所不具备的特性,其与生物分子共同构建的生物传感器能够表现出更为优良的性能。所以,近年来,基于金纳米颗粒的生物传感器受到越来越多的关注,而本论文工作也正是基于此而展开的。1.基于目标分子引发等温指数降解反应的核酸检测新方法核酸序列的特异性检测对于病原体的临床辨别和癌症的早期检测具有十分重要的意义。因此,作者提出了一种灵敏度很高,而且快速、简单、操作方便的核酸序列特异性检测方法。该方法是基于由目标分子引发的等温指数降解反应,即结合了聚合酶的链延伸反应和限制性内切酶的双链切割反应。当体系中存在目标核酸（fM级别）时,连接链就会通过目标分子引发的等温指数降解反应在8.5分钟内被有效降解,随后,探针修饰的金纳米颗粒可以在几分钟时间内实现对此降解反应的检测。整个检测过程只需要15分钟,不仅高效,而且灵敏度高,特异性强,并可有效区分单碱基错配。2.基于缺刻内切酶辅助信号放大的高灵敏钾离子适体传感器在该部分工作,作者通过使用缺刻内切酶（Nt.CviPⅡ）提出了制备高灵敏度和高特异性钾离子适体传感器的新方法。由于缺刻内切酶（Nt.CviPⅡ）可以识别由钾离子适体和连接链形成的双链中特定核酸序列,而且仅仅切割连接链,因此,通过一个精心设计的链切割循环,作者利用缺刻内切酶将钾离子的定量检测转化并放大为连接链的定量检测,并且借助金纳米颗粒比色法检测技术快速简便的优势,通过简单的紫外-可见光谱分析、甚至肉眼直接观测,实现了对连接链以及钾离子的检测。实验结果表明,2μL含有0.1mM钾离子的样品就足够引起金纳米颗粒明显的颜色变化,而钾离子也可以很容易和其他干扰离子区分开来。3.基于金纳米颗粒的三链核酸比色法分析三链核酸技术为基因疾病治疗提供了一种新颖的反基因策略,而三链核酸分析技术是其中最为重要的一个组成部分。因此,基于寡聚核苷酸和金纳米颗粒之间的非特异性相互作用,作者提出了一种三链核酸分析的新方法。当三链核酸形成时,由于金纳米颗粒缺少了单链的三链形成寡聚核苷酸保护,在一定的盐浓度下会发生聚集,金纳米颗粒的颜色也相应地由红色变为蓝色,因此,通过观测金纳米颗粒的颜色变化,可以很容易地检测三链核酸的形成以及辨别不同的三链形成寡聚核苷酸。同时,通过对工作盐浓度的精确控制,作者利用这个体系对三链形成寡聚核苷酸的单核苷酸多态性进行了分析。三链形成寡聚核苷酸因错配碱基变化和序列长度变化产生的单碱基或者双碱基差别都可以通过该方法得到很好的区分。由于此方法具有简便、快速和高度选择性的优势,有望成为一种有效的分析三链核酸和筛选合适的三链形成寡聚核苷酸的技术,以满足实际检测需求。4.金纳米颗粒辅助信号放大的高灵敏汞离子检测技术借助胸腺嘧啶-汞离子-胸腺嘧啶复合物以及金纳米颗粒介导的信号放大反应,作者提出了灵敏检测汞离子的新方法。在本章研究中,作者首先设计了两条5’端修饰了巯基且含有6个胸腺嘧啶-胸腺嘧啶错配位点的互补核酸。其中一条核酸被固定在金电极表面,而另一条核酸被修饰在金纳米颗粒表面。当核酸修饰的金电极浸没在其互补核酸修饰的金纳米颗粒溶液中,因为存在6个胸腺嘧啶-胸腺嘧啶错配,这两条核酸链不能有效杂交形成双链,所以金纳米颗粒也不会固定到金电极表面。然而,当体系中存在汞离子的时候,通过形成胸腺嘧啶-汞离子-胸腺嘧啶复合物,两条核酸就能形成杂交双链,金纳米颗粒就可以固定在金电极表面。此时,大量的六氨合钌分子作为信号探针就会结合到电极表面。本实验中的汞离子检测限为10 nM,完全可以满足国际环境保护机构对饮用水中汞离子检测的要求。5.多功能金纳米颗粒用于亚硝酸根离子高灵敏检测的研究本章中,作者制备了一种多功能金纳米颗粒并将其在亚硝酸根离子的电化学检测中加以运用。金纳米颗粒表面在按照常规方法修饰巯基核酸的同时,还被修饰有5-[1,2]二硫戊环-3-硫辛酸-[2-（萘-1-氨基）-乙基]酰胺（DPAN）,因此,不仅金纳米颗粒表面的核酸分子可以提高该多功能材料的水溶性并提供大量的电化学探针分子六氨合钌的结合位点,而且在亚硝酸根离子存在的条件下,金纳米颗粒表面的DPAN将和电极表面修饰的4-（2-氨乙基）苯胺发生格里斯反应,从而实现亚硝酸根离子的电化学检测。其检测限完全可以满足环境保护机构对饮用水中亚硝酸根离子限定的最高浓度1ppm（21.7μM）的检测要求。6.基于核酸外切酶和金纳米颗粒双重信号放大的核酸分析在本章中,通过使用核酸外切酶Ⅲ和核酸探针P2修饰的金纳米颗粒,作者提出了一种新颖、灵敏、简便的电化学方法检测目标核酸。作者首先将核酸探针P1固定在金电极表面,由于此核酸探针能够自发形成3’端含有5个不配对碱基的刚性茎环结构,从而使其免于被核酸外切酶消化,也阻止了其与固定在金纳米颗粒表面的P2杂交。然而,当体系中存在目标核酸时,目标核酸和固定在电极表面的探针P1形成杂交双链,核酸外切酶Ⅲ就会从P1的3’羟基末端开始对其进行消化,并消化到杂交双链的末端为止。由于目标核酸的循环作用,电极表面的P1被核酸外切酶Ⅲ消化,而消化后的P1分子也由原来的茎环结构变为短的直链结构,并且能够和金纳米颗粒表面的P2杂交,引起电化学信号的放大。实验结果表明,这个基于双重信号放大反应的电化学生物传感器可以非常灵敏和特异地检测目标核酸,线性范围从100 pM到10 nM,检测限为33 pM。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 论文的主要创新点
• 第一章 绪论
• 1.1 金纳米颗粒研究发展史概述
• 1.2 金纳米颗粒的物理性质
• 1.2.1 表面效应
• 1.2.2 小尺寸效应
• 1.2.3 量子尺寸效应
• 1.2.4 宏观量子隧道效应
• 1.3 金纳米颗粒的合成
• 1.3.1 物理法
• 1.3.2 化学法
• 1.3.2.1 溶胶法
• 1.3.2.2 晶种生长法
• 1.3.2.3 反胶束法
• 1.3.2.4 模板法
• 1.3.2.5 相转移法
• 1.4 金纳米颗粒的表征技术
• 1.5 金纳米颗粒的表面修饰
• 1.6 金纳米颗粒在生物传感器中的运用
• 1.6.1 基于金纳米颗粒的光学生物传感器
• 1.6.2 基于金纳米颗粒的电化学生物传感器
• 1.7 生物分析中的电化学技术简介
• 1.7.1 三电极系统
• 1.7.2 电化学方法
• 1.7.2.1 循环伏安法
• 1.7.2.2 交流阻抗法
• 1.3.2.3 计时库仑法
• 1.8 本论文的主要研究内容
• 1.9 参考文献
• 第二章 基于目标分子引发等温指数降解反应的核酸检测新方法
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 实验试剂
• 2.2.2 实验仪器
• 2.2.3 金纳米颗粒的制备
• 2.2.4 探针链修饰的金纳米颗粒的制备
• 2.2.5 目标分子引发的等温指数降解反应
• 2.2.6 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
• 2.2.7 探针链修饰的金纳米颗粒的比色法分析
• 2.3 结果和讨论
• 2.3.1 实验原理
• 2.3.2 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目标核酸
• 2.3.3 探针修饰的金纳米颗粒检测目标核酸
• 2.3.4 检测体系的特异性研究
• 2.4 结论
• 2.5 参考文献
• 第三章 基于缺刻内切酶辅助信号放大的高灵敏钾离子适体传感器
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 实验试剂
• 3.2.2 实验仪器
• 3.2.3 核酸探针修饰的金纳米颗粒的制备
• 3.2.4 缺刻内切酶辅助的信号放大反应
• 3.2.5 基于金纳米颗粒的比色法分析
• 3.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
• 3.3 结果和讨论
• 3.3.1 实验原理
• 3.3.2 钾离子检测的电泳分析
• 3.3.3 钾离子的定量检测
• 3.3.4 检测体系的选择性研究
• 3.4 结论
• 3.5 参考文献
• 第四章 基于金纳米颗粒的三链核酸比色法分析
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 实验试剂
• 4.2.2 实验仪器
• 4.2.3 无修饰金纳米颗粒的制备
• 4.2.4 寡聚核苷酸的溶解
• 4.2.5 目标双链的形成
• 4.2.6 三链核酸的形成
• 4.2.7 金纳米颗粒耐盐性研究
• 4.2.7.1 纯金纳米颗粒耐盐性的研究
• 4.2.7.2 单链核酸存在下金纳米颗粒耐盐性的研究
• 4.2.7.3 双链核酸存在下金纳米颗粒耐盐性的研究
• 4.2.7.4 三链核酸存在下金纳米颗粒耐盐性的研究
• 4.2.8 金纳米颗粒比色法分析三链核酸的形成
• 4.2.9 金纳米颗粒比色法筛选三链形成寡聚核苷酸
• 4.3 结果和讨论
• 4.3.1 实验原理
• 4.3.2 无修饰金纳米颗粒的耐盐性研究
• 4.3.3 单链核酸和双链核酸存在下金纳米颗粒耐盐性的比较
• 4.3.4 三链核酸形成前后金纳米颗粒耐盐性的比较
• 4.3.5 利用金纳米颗粒比色法筛选和目标双链不同结合能力的三链形成寡聚核苷酸
• 4.4 结论
• 4.5 参考文献
• 第五章 金纳米颗粒辅助信号放大的高灵敏汞离子检测技术
• 5.1 引言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 实验试剂
• 5.2.2 实验仪器
• 5.2.3 核酸探针-1修饰的金电极的制备
• 5.2.4 核酸探针-2修饰的金纳米颗粒的制备
• 5.2.5 金电极上的核酸杂交反应
• 5.2.6 电化学检测
• 5.3 结果和讨论
• 5.3.1 实验原理
• 5.3.2 循环伏安法检测汞离子
• 5.3.3 汞离子检测的特异性研究
• 5.4 结论
• 5.5 参考文献
• 第六章 多功能金纳米颗粒用于亚硝酸根离子高灵敏检测的研究
• 6.1 引言
• 6.2 实验部分
• 6.2.1 实验试剂
• 6.2.2 实验仪器
• 6.2.3 金纳米颗粒的制备
• 6.2.4 DPAN的合成
• 6.2.5 多功能金纳米颗粒的制备
• 6.2.6 4-（2-氨乙基）苯胺修饰金电极的制备
• 6.2.7 电化学检测
• 6.3 结果和讨论
• 6.3.1 实验原理
• 6.3.2 多功能金纳米颗粒的透射电镜表征
• 6.3.3 电极界面的交流阻抗研究
• 6.3.4 电化学检测亚硝酸根离子
• 6.3.5 电化学检测的特异性研究
• 6.4 结论
• 6.5 参考文献
• 第七章 基于核酸外切酶和金纳米颗粒双重信号放大的核酸分析
• 7.1 引言
• 7.2 实验部分
• 7.2.1 实验试剂
• 7.2.2 实验仪器
• 7.2.3 核酸探针P1修饰的金电极的制备
• 7.2.4 核酸探针P2修饰的金纳米颗粒的制备
• 7.2.5 电极表面的核酸外切酶Ⅲ消化反应
• 7.2.6 P2修饰的金纳米颗粒和电极表面核酸探针P1的杂交
• 7.2.7 电化学检测
• 7.3 结果和讨论
• 7.3.1 实验原理
• 7.3.2 金电极表面的交流阻抗研究
• 7.3.3 金纳米颗粒电化学信号放大反应的循环伏安法研究
• 7.3.4 目标核酸的定量检测
• 7.3.5 核酸检测的特异性研究
• 7.4 结论
• 7.5 参考文献
• 附录
• 致谢