论文摘要
【目的】构建酵母真核重组表达载体pPIC9K-Ro52,通过电穿孔导入巴斯德毕赤酵母菌SMD1168菌株,在重组酵母SMD1168菌株中诱导Ro52蛋白的表达,获取目的蛋白;并应用初步纯化的重组蛋白产物,建立DIGFA法检测抗Ro52抗体,辅助诊断相关自身免疫性疾病。【方法】1.以人白血病MPN细胞的cDNA文库为模板,PCR扩增人Ro52全长基因序列。将PCR产物回收进行TA克隆并鉴定;将测序正确的TA克隆和pPIC9K抽提质粒双酶切后连接,重组质粒经线性化后采用电穿孔法导入巴斯德毕赤酵母SMD1168株中,构建重组Ro52酵母真核表达载体。2.利用G418筛选高表达的重组菌,并对高表达重组菌进行PCR鉴定;诱导Ro52酵母菌分泌表达获得目的蛋白,经硫酸铵浓缩沉淀,通过SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。3.将纯化浓缩后的重组蛋白Ro52包被于硝酸纤维素薄膜上,建立斑点免疫金渗滤法（DIGFA）检测血清中Ro52抗体反应;并与斑点酶免疫法进行比对和临床评价。【结果】1.以人白血病MPN细胞cDNA文库为模板,PCR扩增人Ro52基因,回收产物进行TA克隆后,送公司测序,TA阳性克隆测序图谱与报道一致。2.成功构建出Ro52抗原酵母真核表达载体,提取pPIC9K-Ro52重组质粒经双酶切后送公司测序,测序结果表明插入片段阅读框和方向正确。3.通过电转化基因导入仪将目的片段导入毕赤酵母SMD1168菌株中,获取了Ro52酵母菌,重组菌经甲醇诱导后表达的产物进行SDS-PAGE电泳分析,得到相对分子量约为50 kD的Ro52表达产物。4. DIGFA法和斑点酶免疫法相比,经X2检验得X2=0.44,p>0.05,检测结果表明两种方法的阳性符合率为95.2%,阴性符合率为94%,总体符合率为95%。【结论】本研究成功构建了Ro52酵母真核重组表达载体,经甲醇诱导获取重组Ro52蛋白,并建立了检测抗Ro52的DIGFA法,检测结果与斑点酶免疫法相符合,待进一步研究后,在临床上会有较大的应用价值。
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标签：抗原论文; 毕赤酵母论文; 真核表达论文; 斑点免疫金渗滤法论文;