印度洋深海多环芳烃降解菌的多样性分析及降解菌新种的分类鉴定与降解机理初步研究

论文摘要

多环芳烃（polyaromatic hydrocarbons，PAHs）是指分子中含有两个或两个以上苯环的烃类，在环境中持久存在，具有广泛的毒性、致突变性、致癌性。探索PAHs在环境中的归宿问题，已发展成为当今环境科学研究的前沿课题之一。生物，尤其细菌是去除环境中PAHs的主力军。而深海环境中与PAHs等有机污染物降解有关的细菌还很大程度上不为人知。寻找高效的PAHs降解细菌，研究其降解基因，探索其代谢途径，能更加有效的将降解菌应用于生物修复。本论文主要对印度洋西南洋中脊深海环境中PAHs降解菌的多样性和重要的PAHs降解菌进行了研究。采集了西南印度洋中脊热液区附近1个水柱（DY105 17AIR-CTD5）的9个深海水层海水样品用混合PAHs（菲、芘、荧蒽、蒽）和单一PAH为碳源进行富集筛选，得到了9个混合PAHs降解菌群和9个菲降解菌群。采用DGGE和单菌分离培养相结合的方法对菌群多样性及菌群富集过程的动态变化进行了分析。同时对2株重要的PAHs降解新菌进行了分类鉴定、基因组学和代谢组学方面较为系统的研究，探讨其降解特性，分析了相关功能基因，推测出了可能的代谢途径。获得的主要结果如下：1．用混合PAHs和单一菲作为碳源，富集印度洋深海海水样品，获得了高效的PAHs降解菌群和菲降解菌群。采用平板分离法，在9个混合PAHs降解菌群中分离到29个不同的属的168株可培养细菌。可培养细菌的系统发育分析表明，它们分别属于6个大类，其中主要是变形菌纲α亚群（62％）和γ亚群（23％）细菌，其它4类分别为变形菌纲β亚群（3％）、高G+C革兰氏阳性菌类群（3％）、CFB类群（6％）和低G+C革兰氏阳性菌类群（3％）。其中α亚群包含29个属中的18个属，种属多样性十分的丰富。单菌降解实验表明，分离获得的大多数菌株都能利用PAHs进行生长。其中Alterierythrobacter、Bacillus、Citricella、Idiomarina、Lutibacterium、Maricaulis、Thalassospira、Martelella、Pseudidiomarina、Roseovarius、Salipiger等菌属未有过PAHs降解的相关报道。2．采用PCR-DGGE法对PAHs降解菌群和菲降解菌群跟踪分析了PAHs降解菌群和菲降解菌群中优势菌的形成过程和菌群的结构动态变化。分析结果表明，虽然不同水层和不同时期的菌群有所不同。但与新鞘氨醇杆菌、食烷菌、节杆菌、巴尔通氏体菌、Azospirillum和Rhodovulum等菌属近缘的菌株是菌群中最常见的优势菌或较优势的菌。其中巴尔通氏体菌、Azospirillum和Rhodovulum等菌属还没有降解PAHs的相关报道，可能是潜在的海洋PAHs降解菌。动态分析发现，第8d是混合PAHs降解菌群富集过程中的关键时期，此时菌群结构变化较明显。此时菌群中对PAHs的代谢可能已经由菲转到对其他PAHs的降解。相比之下，菲的降解菌群在4d时趋近稳定，此后菌群结构没有非常明显的变化。3．从DY105 17A IR-CTD5站位的深海水样中分离了一株高效的PAHs降解菌H25，其16S rRNA基因与新鞘氨醇杆菌属的Novosphingobium pentaromativoransUS6-1T有最高同源性为96．0％。通过生理生化特性、脂肪酸成分的分析，G+Cmol%的测定和DNA-DNA杂交结果表明菌株H25为新鞘氨醇杆菌属的一个新种，命名为（Novosphingobium indicum）。芳环羟基化双加氧酶（ring-hydroxylating dioxygenase，RHDs）是PAHs降解过程中控制苯环的起始加氧，是微生物降解反应的限速步骤。我们通过引物设计，从该菌株中扩增出了两条含有PAHs降解起始双加氧酶大小亚基及其上下游序列的基因片段。比对发现，H25菌株含有至少两套与芳烃降解有关的双加氧酶系统，能较好的利用多种PAHs。这说明在研究不多的未受污染的深海区域蕴藏着许多具有清除有机污染潜力的菌种，是值得进一步探索和研究的新领域。4．对本实验室从西南印度洋中脊沉积物样品（DY105 17A IR-TVG4站点）分离到的Pseudoruegeria属新菌株PTG4-1进行了鉴定。通过16S rRNA基因序列的系统发育分析，生理生化特性的比较，脂肪酸成分的分析及G+Cmol％的测定，确定该菌株为Pseudoruegeria属的一个新种（Pseudoruegeria indicum）。对该菌株的PAHs降解范围和降解率进行了测定发现，该菌株是一株广谱、高效的PAHs降解菌，在环境生物修复中具有较大的应用前景。为了解菌株PTG4-1的代谢机理，就其对菲、二苯并噻吩、荧蒽的代谢中间产物进行了检测和分析，并初步推测出了其主要的代谢途径。从检测结果来看，菌株PTG4-1的代谢途径与以往发现的其他菌属菌株对菲、二苯并噻吩和荧蒽的代谢途径有相似之处，但不完全相同。其具体的代谢相关酶系还在进一步实验中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 多环芳烃简介
• 1.1.1 多环芳烃的结构及特性
• 1.1.2 多环芳烃的来源
• 1.1.3 多环芳烃的毒性及危害
• 1.1.4 多环芳烃在环境中的归宿
• 1.2 PAHs降解菌多样性及群落结构分析方法
• 1.2.1 微生物多样性研究的传统方法
• 1.2.2 微生物多样性研究的现代方法
• 1.2.3 PAHs降解菌群研究
• 1.3 细菌的鉴定与分类
• 1.3.1 脂肪酸分析在细菌鉴定中的应用
• 1.3.2 DNA碱基比例（G+C mol%）
• 1.3.3 DNA-DNA杂交
• 1.3.4 rRNA序列分析
• 1.4 微生物对多环芳烃的降解
• 1.4.1 降解多环芳烃的微生物种类
• 1.4.2 PAHs代谢中的主要酶分类
• 1.4.3 PAHs的好氧代谢途径及相关酶系
• 1.4.4 PAHs的厌氧代谢途径
• 1.4.5 PAHs的微生物共代谢降解
• 1.4.6 主要多环芳烃的微生物代谢途径
• 1.5 本文的研究目的及技术路线
• 1.5.1 本文研究的目的意义
• 1.5.2 技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 环境样品
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 试剂盒
• 2.1.4 工具酶
• 2.1.5 菌株和质粒
• 2.1.6 主要仪器
• 2.1.7 寡核苷酸
• 2.1.8 常用溶液和培养基
• 2.2 基本方法
• 2.3 深海PAHs降解菌的富集、分离和菌群动态变化及优势菌分析
• 2.3.1 PAHs降解菌群的富集
• 2.3.2 PAHs降解菌群不同时期的生长曲线
• 2.3.3 PAHs降解菌群降解能力的测定
• 2.3.4 深海PAHs降解菌群中可培养菌的分离
• 2.3.5 可培养细菌 16S rRNA基因的鉴定与系统发育树的构建
• 2.3.6 可培养细菌PAHs降解能力的测定
• 2.3.7 PAHs降解菌群结构组成及富集过程动态变化的监测
• 2.4 深海PAHs降解细菌新种的分类
• 2.4.1 培养基
• 2.4.2 菌落形态观察
• 2.4.3 16S rRNA基因序列PCR扩增与分析
• 2.4.4 生理生化指标测定
• 2.4.5 PAHs利用范围和降解能力的确定
• 2.4.6 G+C mol%含量的测定
• 2.4.7 菌株脂肪酸成分的分析
• 2.4.8 DNA-DNA杂交分析
• 2.5 重要降解菌PAHs降解起始双加氧酶的研究
• 2.5.1 起始双加氧酶大亚基基因片段的克隆、比对分析
• 2.5.2 起始双加氧酶大亚基基因片段两侧翼序列的获得及分析
• 2.6 PAHs降解菌代谢途径研究
• 2.6.1 PAHs代谢产物的收集
• 2.6.2 PAHs代谢产物及代谢途径的分析
• 3 结果与讨论
• 3.1 印度洋PAHs降解菌的富集、分离和菌群动态变化及优势菌研究
• 3.1.1 印度洋PAHs降解菌群的富集
• 3.1.2 PAHs降解菌群的生长曲线
• 3.1.3 PAHs降解菌群的降解能力
• 3.1.4 PAHs降解菌群中可培养细菌种类
• 3.1.5 可培养细菌基于16S rRNA基因的系统发育分析
• 3.1.6 可培养细菌PAHs降解能力
• 3.1.7 PAHs降解菌群结构组成及动态变化分析
• 3.1.8 讨论
• T的研究'>3.2 一株新鞘鞍醇杆菌属深海PAHs降解细菌新种H25^T的研究
• T的分离'>3.2.1 菌株H25^T的分离
• 3.2.2 菌落形态观察
• 3.2.3 16S rRNA基因序列分析
• T生理生化特性'>3.2.4 菌株H25^T生理生化特性
• T对PAHs的利用范围和降解能力'>3.2.5 菌株H25^T对PAHs的利用范围和降解能力
• T的G+C mol%含量'>3.2.6 菌株H25^T的G+C mol%含量
• 3.2.7 菌株脂肪酸组成成分的分析
• 3.2.8 DNA-DNA杂交结果
• 3.2.9 新鞘鞍醇杆菌新种的描述
• T的PAHs降解起始双加氧酶的研究'>3.2.10 Novosphingobium indicum H25^T的PAHs降解起始双加氧酶的研究
• 3.2.11 讨论
• T的研究'>3.3 一株深海PAHs降解细菌新种PTG4-1^T的研究
• T的分离'>3.3.1 菌株PTG4-1^T的分离
• 3.3.2 菌落形态观察
• 3.3.3 16S rRNA基因序列系统发育分析
• 3.3.4 生理生化特性研究
• 3.3.5 PAHs利用范围和降解能力
• T中G+C mol%含量'>3.3.6 菌株PTG4-1^T中G+C mol%含量
• 3.3.7 菌株脂肪酸组成成分
• 3.3.8 Pseudoruegeria属新种的描述
• T降解途径的初步研究'>3.3.9 PAHs降解菌Pseudoruegeria indicum PTG4-1^T降解途径的初步研究
• 3.3.10 讨论
• 结论、创新点与展望
• 1 结论
• 2 本论文创新点
• 3 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢