水稻瘤矮病毒病毒样颗粒组装及Pns12蛋白的亚细胞定位

论文摘要

水稻瘤矮病毒（Rice gall dwarf virus,RGDV）属于呼肠孤病毒科植物呼肠孤病毒属,自20世纪80年代初在泰国发现以来,已在马来西亚、中国、日本和韩国等水稻产区相继发生且有逐年加重的趋势,对水稻生产造成重大危害。目前虽然已经获得了RGDV基因组12个片段的全序列,但对其基因组各片段编码蛋白所进行的功能研究还不多。为此,本论文利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将P3和P8两个主要结构蛋白在昆虫细胞中进行表达,探讨其装配形成病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）的特点,并对Pnsl2蛋白进行亚细胞定位研究。利用RT-PCR方法获得RGDV的内层衣壳蛋白基因S3,并克隆至pMD-18T载体,EcoRⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒pMD-S3,将S3基因亚克隆到pET-32a表达载体上,转化大肠杆菌（Escherichia coli）E coli Rosetta（DE3）Ⅱ,经IPTG诱导要S3基因获得了表达,SDS-PAGE分析显示表达产物的分子量与预期的重组蛋白分子量相符。将获得的P3重组蛋白免疫大耳白兔制备了多克隆抗体,间接ELISA法测定抗血清效价为1:20480,Western blot印迹分析表明所制备的抗血清具有较强的特异性,可用于核心样颗粒（Core-like particles,CLPs）和病毒样颗粒的组装研究。将S3和S8基因分别克隆到杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBac中,构建二个重组转移质粒:pFB-S3和pFB-S8;将S3和S8基因同时克隆到供体质粒pFastBacDual中,首次构建成双价重组转移质粒pFD-S3/S8。分别将它们转化大肠杆菌DH10Bac,得到三种重组杆粒:rbpFB-S3、rbpFB-S8和rbpFD-S3/S8,经鉴定后分别转染Sf9（Spodoptera frugiperda,Sf9）细胞,获得三种重组病毒:rvpFB-S3、rvpFB-S8和rvoFD-S3/S8。通过四次再感染新鲜Sf9昆虫细胞,裂解后进行SDS-PAGE和Westernblot分析,发现重组病毒rvpFB-S3表达了分子量约为116 kDa的P3蛋白,重组病毒rvpFB-S8表达了分子量约为47 kDa的P8蛋白,重组病毒rvpFD-S3/S8既表达了P3蛋白又表达了P8蛋白,表明RGDV结构基因在昆虫细胞内获得成功表达。将重组病毒感染的Sf9昆虫细胞与昆虫细胞蛋白抽提液混合,10000 r/m离心10min,上清以磷钨酸负染,通过透射电镜观察,rvpFB-S3感染的细胞裂解上清可见到直径约40 nm单层衣壳的的核心样颗粒,共表达P3和P8蛋白的细胞裂解上清可观察到形态和大小都和RGDV病毒粒体一致的病毒样颗粒,但单独表达P8蛋白时并没有观察到病毒样颗粒结构,说明体外共表达P3和P8蛋白可以形成双层衣壳的病毒样颗粒结构。利用Overlap-PCR方法构建了S12基因及其缺失突变体与GFP融合的杆状病毒表达载体,并在Sf9昆虫细胞中对Pnsl2蛋白的亚细胞定位进行了研究。激光共聚焦显微镜观察发现绿色荧光集中于昆虫细胞的细胞核内,当预测的位于Pnsl2蛋白C末端的核定位信号序列(NLS,202KRRPR206)被缺失或碱性氨基酸突变为丙氨酸的突变体,绿色荧光则不能在细胞核中积累,而是与GFP空载体对照类似均匀分布于整个细胞,暗示Pnsl2蛋白具有核定位功能,所预测的NLS（Nuclear localization signal,NLS）可能是一个有功能的核定位信号序列,这是植物呼肠孤病毒属中核定位信号蛋白的首次报道。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 水稻瘤矮病毒研究进展
• 1.1.1 病害的分布与危害
• 1.1.2 病害的传毒介体及其传毒特性
• 1.1.3 血清学
• 1.1.4 病毒粒体结构与特性
• 1.1.4.1 病毒粒体结构
• 1.1.4.2 粒体特性
• 1.1.5 病毒粒体的定位及昆虫介体细胞间的扩散
• 1.1.6 病毒的基因组结构
• 1.1.6.1 病毒基因组的编码策略
• 1.1.6.2 病毒的基因组特性
• 1.1.7 病毒编码的蛋白及功能
• 1.1.7.1 病毒粒体结构蛋白的定位
• 1.1.7.2 RGDV编码的蛋白及其同源蛋白
• 1.1.7.3 病毒编码的结构蛋白
• 1.1.7.4 病毒编码的非结构蛋白
• 1.1.8 病毒基因组的转录、复制和组装
• 1.2 蛋白质的表达及亚细胞定位
• 1.2.1 蛋白质的表达
• 1.2.1.1 蛋白质在大肠杆菌中表达
• 1.2.1.2 蛋白质在昆虫细胞中表达
• 1.2.2 蛋白质的亚细胞定位
• 1.3 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 毒源
• 2.1.2 菌株和细胞
• 2.1.3 质粒
• 2.1.4 实验动物
• 2.1.5 试剂与仪器
• 2.1.6 常用缓冲液的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 cDNA的合成
• 2.2.2 PCR技术
• 2.2.3 PCR产物纯化
• 2.2.4 DNA克隆技术
• 2.2.4.1 连接
• 2.2.4.2 感受态细胞制备
• 2.2.4.3 转化
• 2.2.5 重组质粒的提取与鉴定
• 2.2.5.1 质粒的提取
• 2.2.5.2 PCR鉴定
• 2.2.5.3 酶切鉴定
• 2.2.6 重组质粒DNA的转座与昆虫细胞的转染
• 2.2.6.1 重组质粒DNA的转座
• 2.2.6.2 重组Bacmid DNA的提取与制备
• 2.2.6.3 重组Bacmid转染Sf9细胞
• 2.2.6.4 重组病毒的效价测定
• 2.2.7 内层衣壳蛋白基因甜在大肠杆菌中的表达和抗体制备
• 2.2.7.1 诱导表达
• 2.2.7.2 多克隆抗体制备
• 2.2.7.3 间接ELISA法测定抗血清效价
• 2.2.8 蛋白质SDS-PAGE电泳与Western印迹分析
• 2.2.8.1 蛋白的SDS-PAGE电泳
• 2.2.8.2 电转移
• 2.2.8.3 Western印迹分析
• 2.2.9 重组病毒表达产物的电镜观察
• 3 RGDV内层衣壳蛋白基因S3在大肠杆菌中的表达和抗体制备
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 RGDV-dsRNA的提取和纯化
• 3.1.3 内层衣壳蛋白基因S3的克隆
• 3.1.4 原核表达载体构建
• 3.1.5 诱导表达
• 3.1.6 抗体制备和Western印迹
• 3.1.7 抗血清效价测定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 RGDV-dsRNA的提取和纯化
• 3.2.2 内层衣壳蛋白基因S3的克隆
• 3.2.3 原核表达载体构建
• 3.2.4 利用pET-32a载体在大肠杆菌中表达His融合蛋白
• 3.2.5 多克隆抗体制备
• 3.2.6 抗血清的效价测定
• 3.3 讨论
• 4 水稻瘤矮病毒核心样颗粒和病毒样颗粒的组装
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 质粒与试剂
• 4.1.2 菌株与细胞
• 4.1.3 杆状病毒转移载体构建
• 4.1.3.1 重组杆状病毒转移载体pFB-S3和pFB-S8的构建
• 4.1.3.2 重组杆状病毒双价转移载体pFD-S3/S8的构建
• 4.1.4 重组Bacmid DNA提取与鉴定
• 4.1.5 昆虫细胞转染及重组病毒的PCR鉴定
• 4.1.6 重组蛋白的表达与Western blot检测
• 4.1.7 核心样颗粒和病毒样颗粒的电镜观察
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 杆状病毒转移载体构建
• 4.2.1.1 重组杆状病毒转移载体pFB-S3和pFB-S8的构建
• 4.2.1.2 重组杆状病毒双价转移载体pFD-S3/S8的构建
• 4.2.2 重组Bacmid DNA提取与鉴定
• 4.2.3 昆虫细胞转染及重组病毒的PCR鉴定
• 4.2.4 重组蛋白的表达与Western blot检测
• 4.2.5 核心样颗粒和病毒样颗粒的电镜观察
• 4.3 讨论
• 4.3.1 Bac-to-Bac表达系统的选择
• 4.3.2 双价表达载体构建
• 4.3.3 影响表达的因素与目的蛋白的收获
• 4.3.4 核心样颗粒及病毒样颗粒的形成与作用
• 5 水稻瘤矮病毒Pns12蛋白的亚细胞定位
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 质粒与试剂
• 5.1.2 RGDV Pns12蛋白的结构功能域预测
• 5.1.3 GFP与S12基因的连接与克隆
• 5.1.4 重组杆状病毒转移载体的构建
• 5.1.5 重组杆粒DNA（Bacmid）的提取与鉴定
• 5.1.6 昆虫细胞转染和培养
• 5.1.7 共聚焦显微镜观察
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 RGDV Pns12蛋白的结构功能域预测
• 5.2.2 GFP与S12基因及其突变体的连接与克隆
• 5.2.3 重组杆状病毒转移载体的构建
• 5.2.4 重组穿梭质粒的构建与鉴定
• 5.2.5 Pns12蛋白在昆虫细胞中的定位
• 5.2.6 Pns12蛋白亚细胞定位信号的初步研究
• 5.3 讨论
• 总结
• 参考文献
• 附录1 缩写词与中英文对照
• 附录2 常用缓冲液及培养基配方
• 附录3 攻博期间发表（投稿）的论文
• 致谢