中药来源的两种抗癌药物的细胞毒活性与抑癌基因Pdcd4表达的相关性

论文摘要

传统中药在现代肿瘤治疗中的作用日益受到重视。在传统中药中,某些植物药与虫类药在抗肿瘤方面具有具有巨大的潜力,因此受到人们的高度重视。斑蝥（mylabris）系鞘翅目芜青科昆虫,南方大斑蝥或黑黄小斑蝥的干虫体可入药。斑蝥在我国作为药用己有两千余年的历史,具有攻毒蚀疽、破血散结的作用,用于治疗肿瘤。斑蝥中的有效成分是斑蝥素（cantharidin）,可抑制细胞蛋白质的合成,影响细胞的生长分化。去甲斑蝥素（ norcantharidin,NCTD）是我国自行研制生产的新型抗肿瘤药物,是斑蝥素的去甲基衍生物,具有显著的抗癌活性,其毒、副作用较低,是一种具有升高白细胞作用的抗肿瘤药物。喜树碱（camptothecin,CPT）是从珙桐科植物喜树（Camptotheca acuninata）中分离提取的五环生物碱,是唯一有选择性抑制DNA拓扑异构酶Ⅰ（TopoⅠ）作用的植物抗癌药。其后人们分离出10-羟基喜树碱（Hydroxycamptothecine, HCPT）,其化学结构与喜树碱相似,仅第10位碳原子上的氢为羟基所取代。与喜树碱相比,羟基喜树碱毒性小、抗肿瘤作用更强,使喜树碱类药物在肿瘤防治中起到了重大作用。维甲酸（retinoic acid,RA）是维生素A的衍生物,又称视黄酸或维生素A酸。维甲酸包括多种同分异构体,全反式维甲酸（all-trans retinoic acid,ATRA）是其中重要的一种,全反式维甲酸是体内一种重要的生物活性物质,以往发现在胚胎发育、抑制细胞增殖、促进细胞分化和凋亡以及视觉循环中起着重要的作用。Pdcd4（Programmed cell death 4）是一个凋亡基因,因为它在各种诱导因素引起的小鼠细胞凋亡过程中均表达上调而命名。近年来研究表明它还是一个抑癌基因,它编码的蛋白质在人肺癌、乳腺癌、肠癌、前列腺癌、胰腺癌中表达丢失,提高Pdcd4在小鼠表皮中表达可以抑制致癌物质诱导小鼠上皮癌的发生。Pdcd4作为一种新抑癌物质,在今后的抗肿瘤治疗中可能成为一个新的治疗靶点。本研究的主要内容及结果:（1）选取人胃腺癌BGC-823作为转染宿主,用脂质体转染的方法,通过转染Pdcd4cDNA、空载体和Pdcd4cDNA突变体获取Pdcd4高表达癌细胞株和对照癌细胞株。选取人卵巢癌SK-OV-3作为转染宿主,用脂质体转染的方法,获取Pdcd4下调表达癌细胞株和对照癌细胞株。（2）用western blot方法,分析细胞是否被稳定转染,以及NCTD和HCPT作用转染细胞后Pdcd4蛋白的表达情况,考察两种抗癌药物NCTD和HCPT对Pdcd4表达的影响。结果确认稳定转染Pdcd4表达质粒和Pdcd4抑制质粒。结果发现60umol/LNCTD作用BGC-823三种转染细胞72h后,pdcd4蛋白表达明显下调;80umol/L HCPT作用BGC-823三种转染细胞72h后,Pdcd4蛋白表达明显上调。其机制尚不清楚。（3）用MTT方法,测定NCTD和HCPT对BGC-823转染细胞系的细胞毒活性,分析Pdcd4是否可以影响细胞对药物作用的敏感性。结果显示,NCTD低浓度长时间作用或高浓度短时间作用均能提高Pdcd4转染细胞对NCTD的敏感性。HCPT结果与NCTD相似,也是在低浓度作用长时间或高浓度作用短时间均能提高Pdcd4转染细胞对药物的敏感性。（4）用流式细胞仪测定,分析NCTD和HCPT对BGC-823转染细胞系的细胞周期及细胞凋亡的影响,探讨两种抗癌药物的细胞毒活性机制及Pdcd4的影响。分别用60umol/L NCTD和80umol/L HCPT作用三种转染细胞系0、24、48、72h,用流式细胞仪测定细胞周期和凋亡率。结果显示,NCTD对三种转染细胞均有G2-M期阻滞;NCTD作用72h后,各转染细胞的凋亡率均明显高于对照组,但其转染细胞之间并无显著差别。HCPT对三种转染细胞均有S期阻滞,HCPT作用72h后,各转染细胞的凋亡率均明显高于对照组,但其转染细胞之间并无显著差别。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 Pdcd4 的研究进展
• 1.1.1 Pdcd4 的概述
• 1.1.2 Pdcd4 的表达
• 1.1.3 Pdcd4 的功能
• 1.1.4 小结
• 1.2 去甲斑蝥素的研究进展
• 1.2.1 去甲斑蝥素的抗癌活性及作用机理研究
• 1.2.2 斑蝥素类似物抗癌活性及作用机理研究
• 1.2.3 去甲斑蝥素的临床应用
• 1.3 羟基喜树碱研究概况
• 1.3.1 DNA拓扑异构酶I抑制剂
• 1.3.2 阻断细胞周期
• 1.3.3 促进肿瘤细胞凋亡
• 1.3.4 影响细胞信号转导系统
• 1.4 全反式维甲酸研究概况
• 1.4.1 促进癌细胞分化
• 1.4.2 引起细胞凋亡
• 1.4.3 影响细胞周期
• 1.4.4 抑制端粒酶活性
• 1.4.5 抑制肿瘤血管形成
• 1.4.6 问题与展望
• 2 前言
• 3 实验材料和方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 细胞及其培养基等
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 主要溶液配制
• 3.2 实验方法与步骤
• 3.2.1 细胞培养
• 3.2.2 细胞计数
• 3.2.3 MTT比色法检测抗癌药物的细胞毒活性
• 3.2.4 细胞形态观察
• 3.2.5 蛋白抽提
• 3.2.6 Western-blot分析蛋白质水平表达
• 3.2.7 细胞转染
• 3.2.8 流式细胞仪检测细胞周期与凋亡
• 4 实验结果
• 4.1 获取稳定转染Pdcd4cDNA的人胃腺癌BGC-823 细胞株
• 4.2 去甲斑蝥素对Pdcd4 转染人胃腺癌BGC-823 细胞的细胞毒活性
• 4.3 羟基喜树碱对Pdcd4 转染人胃腺癌BGC-823 细胞的细胞毒活性
• 4.4 获取瞬时转染Pdcd4 抑制表达人卵巢癌SK-OV-3 细胞株
• 4.5 去甲斑蝥素对Pdcd4 抑制表达人卵巢癌SK-OV-3 细胞的细胞毒活性
• 4.6 去甲斑蝥素、羟基喜树碱对BGC-823 转染细胞中Pdcd4 表达的影响
• 4.7 去甲斑蝥素、羟基喜树碱对BGC-823 转染细胞的细胞周期及凋亡的影响
• 5 讨论
• 5.1 去甲斑蝥素作用BGC-823 转染细胞敏感性的变化
• 5.2 羟基喜树碱作用BGC-823 转染细胞敏感性的变化
• 5.3 全反式维甲酸对Pdcd4 转染人胃腺癌细胞BGC-823 的作用
• 5.3.1 全反式维甲酸对Pdcd4 转染BGC-823 细胞的细胞毒活性
• 5.3.2 全反式维甲酸对Pdcd4 转染BGC-823 细胞中Pdcd4 表达的影响
• 5.3.3 全反式维甲酸对Pdcd4 转染BGC-823 细胞的细胞周期和凋亡率的影响
• 5.4 三种抗癌药物对Pdcd4 转染人胃腺癌细胞BGC-823 作用的对比
• 6 结论
• 6.1 去甲斑蝥素对Pdcd4 转染人胃腺癌细胞BGC-823 作用
• 6.2 羟基喜树碱对Pdcd4 转染人胃腺癌细胞BGC-823 作用
• 7 参考文献
• 8 英文缩略词
• 9 致谢