论文摘要
类风湿性关节炎（RA）是一种常见的以关节组织慢性炎症病变为主要表现的全身性疾病。它的发生是由于机体内的T细胞因子引起了关节组织内部对特异性隐蔽抗原进行自身免疫反应,在此过程中导致了多关节滑膜炎症,并造成软骨和骨组织的损害。作为关节软骨主要成分的II型胶原被认为是介导类风湿性关节炎发病的自家抗原成分之一,因此理论上口服补充Ⅱ型胶原蛋白能使机体产生免疫耐受,抑制类风湿性关节炎疾病的发生。鸡胸软骨中含有丰富的Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖,且具有来源广泛、加工便捷、价格低廉等优点,可开发成一类天然无毒副作用,具有防治类风湿性关节炎功能的保健品。本论文以鸡胸软骨为原料制备富含II型胶原的软骨粉,并测定了软骨粉的组成和生物活性,这为开发鸡骨资源、解决家禽加工业的资源综合利用问题提供了理论基础,主要研究内容如下:首先以鸡胸软骨为原料,研究了酶法去除杂质、脱脂、干燥以及粉碎工艺,制备富含生物活性II型胶原的软骨粉。采用胃蛋白酶去除软骨表面杂质,最优酶解条件为酶浓度400 mg·L-1,温度28℃,反应时间24 h,料水比1:5。酶法处理后的鸡胸软骨切片,浸泡在氯仿:甲醇=2:1的混合溶剂中,匀速搅拌,可除去绝大部分脂肪,脂肪的残留率为0.05%。脱脂软骨经冷冻干燥36 h后,仍然能保持原来的色泽和形态,水分含量降至2.18%。采用冷冻研磨机在液氮低温条件下粉碎鸡胸软骨,最优粉碎工艺为预冷时间7 min,撞击速度10次·s-1,粉碎时间9 min,所得的软骨粉的平均粒径为73.37μm。制备得到的软骨粉混悬于4 mol·L-1盐酸胍中,搅拌24 h去除非胶原成分后,采用胃蛋白酶酶解提取II型胶原,并对软骨粉II型胶原的纯度和结构进行了鉴定。结果显示,软骨粉II型胶原在SDS-PAGE电泳谱带出现的位置与Sigma-Aldrich标准品一致,两者的RP-HPLC保留时间接近,氨基酸组成也相似。这说明软骨粉胶原为典型的II型胶原,其分子可以用α1（II）3来表示。软骨粉II型胶原在近紫外区220 nm附近产生最大吸收,而280 nm处吸收很弱,表明其中芳香族氨基酸含量较少,这和氨基酸分析结果一致,园二色谱在221 nm和198 nm处分别出现正负吸收峰,符合II型胶原左旋聚脯氨酸肽链的典型特征。软骨粉II型胶原的FT-IR分析与文献报道的天然II型胶原的吸收峰位基本一致。差示扫描量热仪测定软骨粉胶原的变性温度为44℃,说明软骨粉II型胶原在制备和提取过程中结构没有遭到破坏。X-射线衍射测定结果表明,软骨粉II型胶原为三股超螺旋链结构,其中每条α链是独立的左手螺旋结构,衍射峰的强度达到80%,说明软骨粉II型胶原很好地保持了三股螺旋结构,因而保持了其生物活性。以纯II型胶原和完全弗氏佐剂免疫Sprague-Dawley（SD）大鼠,建立大鼠的类风湿性关节炎模型（CIA）,研究了口服鸡胸软骨粉和硫酸氨基葡萄糖对大鼠类风湿性关节炎病程的影响。结果表明,口服鸡胸软骨粉能明显降低CIA大鼠的关节炎指数,缓解关节红肿等症状。同时,实验组大鼠的T淋巴细胞增殖受到抑制,抑炎细胞因子白介素-2（IL-2）水平高于阴性对照组,而白细胞介素-1（IL-1）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平则显著低于阴性对照组和阳性对照组。硫酸氨基葡萄糖的添加在一定程度上也缓解了大鼠的RA症状。这为开发鸡胸软骨粉制备安全有效、无副作用的保健品应用于防治类风湿性关节炎提供了理论依据。