采用同源重组技术构建PrA低表达且能分泌LTP1的酿酒酵母菌株及其性能研究

论文摘要

酿酒酵母蛋白酶A（PrA）〔EC3.4.23.25〕为酿酒酵母产生的一种酸性蛋白水解酶。纯生啤酒采用低温膜过滤除菌达到生物稳定性,因而蛋白酶A的活性不被破坏。由于啤酒的pH值在4.3-4.4的酸性范围内,因此啤酒被消费者消费之前,蛋白酶A都会降解啤酒中的蛋白和多肽,尤其是当啤酒中的泡沫阳性蛋白被蛋白酶A降解后会导致啤酒的泡沫衰减、泡持性降低。啤酒的泡沫性能是用来衡量啤酒质量的一个重要指标。前人的研究结果证实啤酒中的大麦脂转移蛋白1（LTP1）是对啤酒泡沫稳定性最为关键的蛋白,这种蛋白是底物特异性较小的酵母蛋白酶A的作用底物,这使得纯生啤酒的泡沫衰减问题更加突出。为从根本上解决纯生啤酒的泡沫衰减问题,本研究论文中从酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）基因组中通过PCR分别扩增得到了酿酒酵母乙醇脱氢酶启动子（ADH1 promoter）, MFal信号肽序列（MFals）、细胞色素C终止子序列（CYC1 terminator）等表达调控DNA序列；从二棱大麦（Hordeum vulgare）基因组中扩增得到了大麦脂转移蛋白1（LTP1）的编码序列,并构建了酿酒酵母的大麦脂转移蛋白1的表达盒。将遗传霉素G418的抗性序列KanMX作为筛选标记与大麦Ltp1表达盒共同克隆到质粒YEplacl81的多克隆位点中,得到酿酒酵母大麦LTP1分泌表达型质粒YEp181-KAMLC。使用质粒YEpl81-KAMLC对酿酒酵母WZ65进行转化并使用酿酒酵母转化子菌株进行发酵实验,采用HPLC对大麦Ltp1表达盒的下游产物进行检测。检测结果表明,大麦脂转移蛋白1在酿酒酵母菌株WZ65中得到了分泌表达,在发酵开始的24小时内大麦脂转移蛋白1的产量增加较为缓慢,之后有较大的提高,72小时后大麦脂转移蛋白1分泌量的增加速度变慢。随着发酵时间的延长,大麦LTP1的产量-直呈现上升趋势。到发酵的132小时,发酵液中大麦脂转移蛋白1的分泌量达到29.45mg／L。使用含有大麦Ltp1表达盒和KanMX标记序列的转化DNA片段同源重组到酿酒酵母基因组上PEP4基因位点,使一个PEP4等位基因的编码序列被外源基因序列所替换。这样将会使酿酒酵母在表达啤酒泡沫阳性蛋白-大麦LTP1的同时,由于PEP4一个等位基因的缺失而造成其编码产物-蛋白酶A表达的降低,从而达到既增加泡沫阳性蛋白LTP1的含量,又有效降低其被蛋白酶A的降解作用。通过对转化子的筛选和鉴定,得到了基因型为PEP4/pep4::KanMX-Ltpl的酿酒酵母重组子菌株。对得到的重组菌株进行发酵培养,通过采用变性不连续SDS-PAGE釉Tricine-SDS-PAGE方法对经过处理的发酵液进行分析发现,本实验中所用到的对酿酒酵母重组菌分泌到培养液的大麦LTP1两种电泳分析方法中,Tricine-SDS-PAGE方法要比普通的SDS-PAGE方法优越。酵母表达的分子量大小约10KDa的蛋白条带能够得到很好的分离。进一步免疫印迹实验证实,重组菌株分泌的分子量对应于10KDa左右的表达产物为大麦LTP1。为了确保重组菌株在工业生产中的安全性,需要对抗性选择标记KanMX进行删除。TEF1启动子不能被本实验中所用的酿酒酵母表达系统所识别,因此使用TEF promoter更换了Sh ble表达盒中的TEF1 promoter,并构建了质粒pSH47/ZEO,利用Cre/loxP系统对重组子染色体上的KanMX进行了删除,并成功的使酵母细胞丢掉了质粒pSH47/ZEO.最终获得了大麦Ltp1表达盒结构完整、整合位点精确的酿酒酵母重组菌株。对不同发酵时期LTP1的浓度检测结果表明,在12°P未加酒花的麦汁中重组菌株S.c-Ltplα和S.c-Ltplβ在发酵第108小时分泌大麦LTP1的浓度分别达到18.76和18.28mg/L；在8°P添加酒花的麦汁中重组菌株S.c-Ltplα釉S.c-Ltplβ在发酵第108小时分泌大麦LTP1的浓度分别达到12.07和12.13mg/L。对获得的重组菌株S.c-Ltplα釉S.c-Ltplβ进行继代培养并对其遗传稳定性、生长性能、发酵力、絮凝性和蛋白酶A活性等生理生化指标进行了测试。重组菌株经过继代培养30代后遗传性能稳定。重组菌株与出发菌株相比,蛋白酶A活性降低了30%左右,对数生长期变慢,但稳定期的细胞浓度与对照菌基本相当,其他生理指标与对照菌株无明显差异。通过酿酒试验对多项指标的测试结果表明,重组菌株酿造的啤酒口味与现行其他干啤相近,各项理化指标均达到国家标准优级,泡持时间从原来的202s提高到326s。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 前言
• 2 影响纯生啤酒泡沫稳定性的因素
• 2.1 啤酒的泡沫性质
• 2.2 啤酒泡沫的物理特性
• 2.3 啤酒泡沫的化学分子特性
• 2.4 啤酒的化学成分及其对泡沫的影响
• 2.5 发酵菌种和生产原料对啤酒泡沫的影响
• 2.6 生产工艺对啤酒泡沫的影响
• 3 与啤酒泡沫相关的主要的蛋白和蛋白酶
• 3.1 Z-蛋白
• 3.2 脂转移蛋白1（LTP1）
• 3.2.1 脂转移蛋白1（LTP1）的构成
• 3.2.2 脂转移蛋白1（LTP1）的生物学功能
• 3.2.3 脂转移蛋白1（LTP1）对啤酒泡沫的影响
• 3.2.4 脂转移蛋白1（LTP1）在植物中的表达
• 3.3 酿酒酵母蛋白酶A
• 3.3.1 蛋白酶A的编码
• 3.3.2 酵母蛋白酶A的结构
• 3.3.3 蛋白酶A的生化特性
• 3.3.4 蛋白酶A的分泌途径
• 3.3.5 酵母蛋白酶A对啤酒泡沫稳定性的影响
• 3.3.6 蛋白酶A的测定
• 3.4 液泡内的其它蛋白酶
• 4 改善纯生啤酒泡沫的主要策略
• 4.1 选用优质的生产菌株和原辅料
• 4.2 优化生产工艺
• 4.3 使用泡沫添加剂
• 5 利用同源重组技术在酿酒酵母中表达外源基因
• 5.1 同源重组
• 5.2 外源基因在酿酒酵母细胞中的表达
• 5.3 基因工程技术对啤酒质量的改善
• 5.3.1 提高啤酒的胶体稳定性
• 5.3.2 提高生香物质含量
• 5.3.3 选育嗜杀啤酒酵母
• 5.3.4 分解葡聚糖
• 6 前景与展望
• 7 选题背景与研究思路
• 第二章 大麦Ltp1酿酒酵母表达盒的构建
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料、主要试剂和仪器设备
• 2.1.1 种子、菌株、质粒
• 2.1.2 主要试剂及配制
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 主要实验仪器和设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 二棱大麦（Hordeum vulgare）基因组提取
• 2.2.2 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）基因组提取
• 2.2.3 大麦Ltp1酿酒酵母表达盒的构建
• 3 结果与讨论
• 3.1 基因片段的扩增
• 3.1.1 大麦脂转移蛋白1编码基因（Ltp1）的扩增
• p）序列的扩增'>3.1.2 乙醇脱氢酶启动子（ADH1 promoter,ADH1_p）序列的扩增
• s的扩增'>3.1.3 分泌信号MFα1_s的扩增
• T）序列的扩增'>3.1.4 酿酒酵母细胞色素C终止子（CYC1 terminator,CYC1_T）序列的扩增
• 3.1.5 KanMX的扩增
• 3.2 大麦Ltp1表达盒的构建
• s与Ltp1基因片段的三引物连接'>3.2.1 MFα1_s与Ltp1基因片段的三引物连接
• 3.2.2 ML片段与CYC1终止子DNA片段的连接
• 3.2.3 复合DNA片段MLC的PCR鉴定
• 3.2.4 ADH1启动子克隆到载体pUC18
• 3.2.5 复合DNA片段MLC克隆到质粒pUC-ADH1p
• 4 小结
• 第三章 大麦Ltp1酿酒酵母表达盒的测试
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料、主要试剂和仪器
• 2.1.1 菌株、质粒
• 2.1.2 主要试剂及配制
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 主要实验仪器和设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 PCR 引物的合成
• 2.2.2 基因片段的PCR扩增
• 2.2.3 酶切与连接
• 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.5 酿酒酵母的电击转化
• 2.2.6 酿酒酵母转化子的筛选
• 2.2.7 表达产物的检测
• 3 结果与分析
• 3.1 DNA片段KAMLC的PCR扩增
• 3.2 DNA片段KAMLC的鉴定
• 3.3 质粒YEp181-KAMLC的构建
• 3.4 质粒YEp181-KAMLC的鉴定
• 3.5 酿酒酵母转化子的鉴定
• 3.6 大麦LTP1的HPLC标准曲线
• 3.7 YEp181-KAMLC酿酒酵母转化子LTP1的分泌表达
• 4 讨论
• 5 小结
• 第四章 大麦Ltp1表达盒在酿酒酵母PEP4位点的重组
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料、主要试剂和仪器
• 2.1.1 菌株、质粒
• 2.1.2 主要试剂及配制
• 2.1.3 酿酒酵母培养基
• 2.1.4 主要实验仪器和设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 PCR引物的合成
• 2.2.2 酿酒酵母同源重组转化DNA片段的PCR扩增
• 2.2.3 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.4 酿酒酵母的电击转化
• 2.2.5 酿酒酵母转化子的筛选
• 2.2.6 表达产物的免疫印迹检测
• 3 结果和分析
• 3.1 重组转化DNA片段的PCR扩增
• 3.2 酿酒酵母转化子的筛选与鉴定
• 3.2.1 重组位点鉴定
• 3.2.2 重组位点的等位基因
• 3.2.3 重组子基因型的确定
• 3.3 表达产物的变性电泳
• 3.4 表达产物的免疫学检测
• 4 讨论
• 4.1 基因重组的位点
• 4.2 酿酒酵母重组子发酵产物的蛋白电泳
• 5 小结
• 第五章 酿酒酵母重组子抗性标记基因的删除
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料、主要试剂和仪器
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 主要试剂及配制
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 主要实验仪器和设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 ZeoCassette的PCR扩增
• 2.2.2 Gall Promoter的PCR扩增
• 2.2.3 TEF promoter的PCR扩增
• 2.2.4 Gall promoter与ZeoCassette的连接
• p-Sh ble-CYCl_T-Gall_p的连接'>2.2.5 TEF promoter与DNA片段EM7_p-Sh ble-CYCl_T-Gall_p的连接
• 2.2.6 质粒pSH47/ZEO的构建
• 2.2.7 质粒pSH47/ZEO对酿酒酵母重组子S.c-ltp1的转化
• 2.2.8 质粒pSH47/ZEO的酿酒酵母转化子的筛选及鉴定
• 2.2.9 Cre重组酶的诱导表达
• -菌株的筛选'>2.2.10 KanMX^-菌株的筛选
• -菌株的PCR鉴定'>2.2.11 KanMX^-菌株的PCR鉴定
• -菌株的G418抗性实验'>2.2.12 KanMX^-菌株的G418抗性实验
• 2.2.13 质粒pSH47/ZEO的去除
• 2.2.14 丢失质粒pSH47/ZEO的酵母菌株的PCR鉴定
• 2.2.15 重组菌株S.c-ltp1中Ltp1表达盒完整性的PCR验证
• 3 结果和分析
• 3.1 ZeoCassette、Gall Promoter和TEF Promoter的PCR扩增
• 3.2 ZeoCassette与Gall Promoter的连接
• T-Gall_P的连接'>3.3 TEF promoter与DNA片段EM7p-Sh ble-CYC1_T-Gall_P的连接
• 3.4 质粒pSH47/ZEO的构建
• 3.5 质粒pSH47/ZEO的酿酒酵母转化子的PCR鉴定
• -菌株的鉴定'>3.6 KanMX^-菌株的鉴定
• 3.7 质粒pSH47/ZEO的丢失
• 3.8 重组菌株S.c-Ltp1中Ltp1表达盒的完整性
• 4 讨论
• 4.1 质粒pSH47的改造
• 4.2 KanMX标记基因的删除
• 5 小结
• 第六章 重组酵母菌株的遗传稳定性及其发酵性能
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料和主要试剂
• 2.1.1 酵母菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 工具酶和主要试剂
• 2.2 主要仪器和设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 重组菌与对照菌的继代培养
• 2.3.2 重组菌株抗性丢失的遗传稳定性
• 2.3.3 重组菌株Ltp1表达盒的遗传稳定性
• 2.3.4 蛋白酶A的活性
• 2.3.5 大麦LTP1的表达
• 2.3.6 生长性能试验
• 2.3.7 发酵力试验
• 2.3.8 凝聚性试验
• 3 结果和分析
• 3.1 重组子抗性丢失的遗传稳定性
• 3.2 重组子Ltpl表达盒的遗传稳定性
• 3.4 脂转移蛋白1的分泌性能及传代稳定性
• 3.5 生长性能
• 3.6 发酵性能
• 3.7 凝聚性
• 4 讨论
• 5 小结
• 第七章 重组菌株的酿酒试验
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 酵母菌种及原料
• 2.2 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 麦汁培养基的制备
• 2.3.2 啤酒酿造试验方法
• 2.3.3 理化指标及性能分析
• 3 结果与讨论
• 3.1 各种理化指标的测定结果
• 3.2 酵母菌性能测试
• 4 小结
• 第八章 主要结论
• 8.1 结论
• 8.2 主要创新成果
• 8.3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士期间发表学术论文