论文摘要
媒介昆虫的拟除虫菊酯抗性已经在世界范围内存在,是控制媒介传染病的一个主要障碍。为阐明媒介昆虫对拟除虫菊酯的抗性机制,本实验室先前已经鉴别并报道了一系列拟除虫菊酯代表种溴氰菊酯抗性相关基因,其中包括糜蛋白酶基因。其后,通过将糜蛋白酶基因过表达和RNA干涉,进一步证实糜蛋白酶基因上调是引起溴氰菊酯抗性的原因之一。为进一步研究糜蛋白酶对溴氰菊酯的作用,我们进行糜蛋白酶体外直接催化降解溴氰菊酯实验,并测定了该酶解反应的相关动力学参数。应用气相色谱-质谱联用仪和紫外-可见光分光光度法来检测糜蛋白酶降解不同浓度（4.96-24.80μM）溴氰菊酯,其定量检测是通过检测反应体系中溴氰菊酯的减少来实现。溴氰菊酯的糜蛋白酶降解物（含未被降解的溴氰菊酯底物）保留时间分别为37.968 min、37.415min、36.490 min和35.895 min。与NIST质谱数据库比对后发现,37.968 min为未被降解的溴氰菊酯,其余峰为溴氰菊酯的糜蛋白酶降解产物。溴氰菊酯紫外-可见光分光光度法测量的吸收波长为264 nm,其代谢产物吸收波长分别为250 nm和296 nm。应用GraphPad Prism4.0软件非线性回归分析糜蛋白酶降解溴氰菊酯米氏代谢速率常数（Vmax和Km）,其最大反应速度和米氏常数分别为97.97±26.57nmol/L/min和7.84±3.83μM。淡色库蚊溴氰菊酯敏感和抗性品系四龄幼虫生物测定显示溴氰菊酯糜蛋白酶降解物的LC50显著减低,Wistar大鼠急性口服毒性试验结果显示,降解产物毒性显著低于溴氰菊酯（p＜0.05）。本研究首次报道糜蛋白酶可降解非蛋白小分子化合物溴氰菊酯。该实验结果深化了昆虫对拟除虫菊酯抗性机制的认识,并提示糜蛋白酶可望作为杀虫剂污染环境及农产品的生物降解剂候选分子,值得进一步研究。
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