茶树种子脱水过程差异基因的研究

论文摘要

茶树是我国重要的经济作物之一,茶叶作为我国重要出口创汇的农产品。由于自然和人为的因素,茶树种质资源的流失由来已久,尤其到了20世纪,因为人口激增、毁林开荒和经济建设等方面原因大大加速了这一过程;与此同时,在茶叶生产上,茶树的繁殖多采用短穗扦插的无性生殖方式,有利于优良性状的稳定遗传,但良种推广使大量地方品种淘汰,非经济性状优异种质流失。妥善保存和利用各类茶树资源已成为目前当务之急的工作,对当前和未来的茶叶研究和生产都具有重要意义。而这些方面种子繁殖具有很大的优势。茶树的种子是茶树本身自然繁殖的后代,贮藏着完整的遗传信息,作为保存材料携带、运输和贮藏都非常方便,对繁衍和传播具有重要作用,长期保存种子是解决品种退化的关键,因此研究茶树种子贮藏的意义显得尤为重要。大多数植物的种子可在低含水率（2%～5%,甚至更低）和低温或超低温条件下贮藏,但茶树等顽拗型种子,在失水较多（低于临界含水量）的情况下就会丧失生活力,如茶树的临界含水量高达16%-20%,这么高的含水量不可能长期保存。目前对茶树类顽拗性种子在脱水方面的研究主要集中在脱水过程中生理、生化和细胞学等领域。脱水对细胞的伤害是多方面的:脱水引起顽拗型种子衰老或死亡的原因尚不清楚,从分子水平上探索与茶树有关的特征性代谢产物的研究进展较快,一些与茶树品质相关的功能性基因相继得以克隆研究,但是对茶树脱水引起死亡相关的分子生物学研究基本是空白。因此,茶树脱水相关基因的表达研究,对阐明茶树因脱水引起的衰老和死亡机理有重要的理论意义,为将来利用生物技术保存茶树种子奠定理论基础,本文以茶树品种龙井43为材料,重点进行如下研究:一是关于茶树种子成熟时形态指标和生理指标的确定,二是关于不同脱水程度的茶树种子的差异表达,利用cDNA-AFLP技术,获得不同脱水程度的TDF片段进行分析,寻找与脱水引起茶树种子衰老死亡相关的基因进行全长克隆和分析。脱水耐性的获得不仅仅是某种单一因子的作用,而是涉及多种因素的更为复杂的过程。用分子方法提高种子的脱水耐性具有重要的意义。主要结果如下:对成熟前七周的茶树品种龙井43种子观察并确定其成熟时的形态指标及生理指标含水率及叶绿素含量,研究结果表明,茶树品种种龙井43种子成熟时的含水率及叶绿素含量约为鲜重的36%和0.2ng/g。利用cDNA-AFLP技术对茶树脱水过程中差异基因表达进行了分析。通过NCBI进行BLAST比对发现,结果表明,差异片段1与拟南芥衰老蛋白有很高的同源性;差异片2与PPR蛋白同源性很高;差异片段3与硫氧还蛋白同源性很高,差异片段4与翻译控制肿瘤蛋白同源性较高;其余2条差异片段功能尚不明确。利用RACE技术获得该基因cDNA全长为1061bp,经BLAST查找比对,该基因的核苷酸序列与衰老蛋白基因同源性较高。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 茶树种质资源研究现状
• 1.2 种子脱水研究现状
• 1.3 cDNA-AFLP在研究特异表达基因中的应用
• 1.3.1 cDNA-AFLP的原理
• 1.3.2 cDNA-AFLP在植物上的应用
• 1.3.3 cDNA-AFLP在茶树上的应用前景
• 2 引言
• 2.1 研究意义
• 2.2 研究路线
• 2.3 研究内容
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.2 主要仪器设备
• 3.3 试验试剂
• 3.4 方法
• 3.4.1 茶树种子成熟度的测定
• 3.4.2 茶树种子脱水过程中差异基因的研究
• 3.4.3 衰老蛋白全长cDNA的克隆
• 4 结果与分析
• 4.1 茶树种子成熟度的测定
• 4.1.1 形态上的成熟
• 4.1.2 生理上的成熟
• 4.2 茶树种子胚总RNA纯度与完整性检测
• 4.3 cDNA-AFLP第一链及第二链的检测
• 4.4 cDNA-AFLP分析
• 4.5 差异片段的分离、回收及克隆
• 4.6 差异片段的序列分析
• 4.7 衰老蛋白cDNA的反应、克隆及测序
• 4.7.1 衰老片段的3'RACE扩增
• 4.7.2 衰老基因片段的5'RACE扩增
• 4.7.3 衰老基因cDNA全长序列的扩增
• 5 小结与讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介