苏云金芽孢杆菌新助剂筛选及发酵因子优化

论文摘要

蚊虫传播着各种可怕的疾病，是人类生存和健康的大敌。为寻找高效的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）杀蚊菌株资源，本文从国家一级风景保护区武夷山等福建省多个地区采集土壤样品，采用热处理法从125份土壤中分离出71株Bt分离株，并对致倦库蚊进行生物测定，初筛得到5株（QQ13、QQ17、QQ42、QQ66和QQ92）有效菌株，其中QQ17、QQ66和QQ92有较高的毒性。这将对致倦库蚊的生物防治起到重要的促进作用。作为主要的微生物杀虫剂，Bt在孢子囊期合成蛋白水解酶。然而，Bt蛋白酶是否对杀虫晶体蛋白的功效有影响仍然是个争议性的话题。为探讨Bt特异蛋白酶在细胞生长及晶体蛋白稳定性中的作用，以及进一步探索这些蛋白酶在工业应用上的可能性，研究设计了蛋白酶基因保守区引物，对Bt的蛋白酶基因片段进行克隆及初步分析。结果表明，从Bt库斯塔克亚种菌株8010中获得了6个蛋白酶基因片段，即中性蛋白酶A、色氨酸合成酶β链、色氨酸合成酶α链、碱性蛋白酶A、磷酸化水解酶基因和糖原磷酸化酶及1个未知功能的DNA片段（可能是编码蜡质芽孢杆菌组特有蛋白的基因）。此外，本文报道了一个非常简单而且快速的提取苏云金芽孢杆菌总DNA方法。近年来，对Bt的增效途径探索逐渐成为其研究热点之一。其中，开发新剂型是重要手段之一。而开发一种新剂型，助剂是关键因素。良好助剂可改善制剂的理化性质并提高使用效果。通过对5种助剂进行筛选，本研究提出了一个新的Bt助剂研究选择方法，得到了对该制剂既能提高湿润性又能增效的BCM-101和JFC新型助剂，以提高Bt制剂的杀虫活性。本文还研究了Bt工业发酵后处理过程，旨在探讨发酵后处理过程对成品效价的影响，优化发酵后处理过程，设计和研究Bt发酵过程的调控方案，为全程性、自动化调控发酵提供依据。生产实践证明，对于本研究的工业生产菌株而言，其最佳通气量为1：1-1：1.2，温度范围为30-33℃。此外，随着发酵的进行，发酵液的pH值也出现一系列的变化。发酵后处理过程中，喷雾干燥多用于生产高效价（16000IU／mg以上）的Bt产品，板框压滤则多用于低效价（12000IU／mg以下）产品的生产。其中以喷雾干燥为主。在喷雾干燥过程中，膜过滤及干燥时间等因素，都会间接影响产品的效价。营养型生长调节剂TA-BR主要是由生长活性物质TA和油菜素内酯BR混配而成的生物肥料，对很多种植物具有良好的增产和改善品质的功能。本文据此研制了一种新型生物药肥，它集苏云金杆菌杀虫剂与营养型生长调节剂TA-BR于一体。研究结果表明，喷施生物药肥后，质量和产量均明显提高，鲜叶亩产量增幅为6.76-26.90％，酚氨比明显降低，水浸出物、水溶性糖及维生素C均有所增加。同时，生物药肥对茶毛虫、茶尺蠖和茶蚕等茶树主要鳞翅目害虫的防效可达90％以上，且对天敌安全。综上所述，本文从菌种的分离和鉴定、毒力相关基因的获得、助剂的筛选、工业发酵过程监控与分析和生物药肥的研发及应用等方面对Bt进行研究。在第2章，本研究进一步丰富了Bt菌种资源，筛选到3株对致倦库蚊高效的Bt菌株，为高效杀蚊微生物制剂的研发奠定了良好基础。通过第3章的研究，我们利用蛋白酶基因保守区引物得到了6个蛋白酶基因片段，获得了一个可能是蜡质芽孢杆菌组特异的蛋白基因，进一步丰富了Bt毒力相关基因的研究。在第4章，本研究采用引进的农药助剂，直接在生物农药企业试验，发现了一些新的有效助剂，用于改善Bt原粉的理化性质，提高湿润性和附着率，对Bt制剂起到较好增效作用。本文在第5章中对Bt工业发酵后处理过程进行监控，提高了Bt发酵后处理的控制能力。在第6章，本着既有杀虫作用又能促进茶叶产量和质量为研制目的研制了一种生物药肥。它的成功研发可极大地促进无公害茶叶的发展，综合实现生态效益、经济效益和社会效益。由于苏云金芽孢杆菌在生物防治中扮演着重要角色，上述工作可为苏云金芽孢杆菌的进一步研发奠定良好基础。

论文目录

• 目录
• 插图清单
• 附表清单
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第1章 苏云金芽孢杆菌（Bt）研究进展
• 1.1 Bt 研究概况
• 1.2 菌种分离及鉴定
• 1.3 农药助剂研究
• 1.3.1 助剂对农药使用的影响
• 1.3.1.1 助剂对药液附着量的影响
• 1.3.1.2 助剂对农药附着率的影响
• 1.3.1.3 助剂对药液展布性的影响
• 1.3.1.4 助剂对农药吸收的影响
• 1.3.2 国内外助剂研究现状
• 1.3.2.1 助剂对对生物体渗透性研究进展
• 1.3.2.2 桶混助剂的应用概况
• 1.3.2.3 助剂提高耐雨水冲刷能力的研究概况
• 1.4 Bt 发酵和制剂研究
• 1.4.1 历史沿革
• 1.4.2 发酵培养基的优化
• 1.4.2.1 碳源
• 1.4.2.2 氮源
• 1.4.2.3 矿物质
• 1.4.2.4 试验设计
• 1.4.3 发酵条件的研究
• 1.4.3.1 溶氧量
• 1.4.3.2 发酵温度
• 1.4.3.3 接种量
• 1.4.3.4 pH值
• 1.4.3.5 发酵方式
• 1.4.4 发酵后处理
• 1.4.5 产品标准
• 1.5 Bt 与中国茶叶
• 1.5.1 中国茶叶总体情况
• 1.5.2 无公害茶叶与生物药肥
• 1.6 问题与展望
• 1.7 本研究的目的和意义
• 第2章 Bt 新菌株资源的采集与鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.1.1 分离培养基
• 2.1.1.2 实验药剂
• 2.1.1.3 土壤样本
• 2.1.1.4 供试昆虫
• 2.1.1.5 实验主要仪器
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 样品采集
• 2.1.2.2 菌株分离
• 2.1.2.3 镜检
• 2.1.2.4 生物测定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 新菌株资源的采集及鉴定
• 2.2.2 生物测定
• 2.3 小结与讨论
• 第3章 Bt 蛋白酶基因保守区的克隆及序列分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株和培养条件
• 3.1.2 Bt 8010 DNA 模板链的制备
• 3.1.3 蛋白酶基因保守区的 PCR
• 3.1.4 蛋白酶基因片段的克隆
• 3.1.5 序列分析
• 3.1.6 GenBank 登录号
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 简并引物的设计
• 3.2.2 Bt 基因组 DNA 的提取
• 3.2.3 蛋白酶基因保守区的 PCR 扩增
• 3.2.4 蛋白酶基因保守区的克隆和序列分析
• 3.3 小结与讨论
• 第4章 提高 Bt 和湿润性的新助剂选择
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 供试材料
• 4.1.2 仪器
• 4.1.3 供试昆虫
• 4.1.4 材料处理
• 4.1.5 湿润性的检测
• 4.1.6 pH值测定
• 4.1.7 水分检测
• 4.1.8 重复试验
• 4.1.9 分梯度测定
• 4.1.10 增效试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 助剂对湿润性的影响
• 4.2.2 助剂对 Bt 的增效作用
• 4.2.2.1 助剂浓度选择对效价的影响
• 4.2.2.2 Bt 添加助剂后的效价比较
• 4.3 小结与讨论
• 第5章 Bt 工业发酵后处理过程的监控与数据分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 Bt 发酵后处理生产数据的采集
• 5.1.2 Bt 发酵后处理生产数据查询系统
• S.1.3 Bt 发酵后处理生产数据查询系统的实现
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 膜过滤数据分析
• 5.2.1.1 加酸量与混合液重量的关系
• 5.2.1.2 无机膜浓缩液比与过滤时间的关系
• 5.2.1.3 有机膜浓缩液比与过滤时间的关系
• 5.2.2 喷雾干燥数据分析
• 5.2.2.1 烘干时间与批产量之间的关系
• 5.2.2.2 升温开始进风温度与批产量关系
• 5.2.2.3 升温开始排气温度与批产量的关系
• 5.2.2.4 升温结束进风温度与批产量的关系
• 5.2.2.5 升温结束排气温度与批产量的关系
• 5.3 小结与讨论
• 第6章 生物药肥的研制及其在茶树上的应用
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.1.2.1 试验地点和茶树品种
• 6.1.2.2 对茶叶质量与产量影响的测定
• 6.1.2.3 对茶树主要鳞翅目害虫的药效试验
• 6.1.2.4 对茶园天敌的影响
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 对茶树产量的影响
• 6.2.1.1 对发芽密度的影响
• 6.2.1.2 对一芽二叶长度的影响
• 6.2.1.3 对百芽重的影响
• 6.2.1.4 对亩产的影响
• 6.2.2 对茶叶内含物的影响
• 6.2.3 对茶树主要鳞翅目害虫的防治
• 6.2.4 对茶树主要天敌的影响
• 6.3 小结与讨论
• 总结
• 参考文献
• 附录1 攻博期间发表论文
• 致谢