交沙霉素生产菌株的菌种选育研究

论文摘要

通过对本实验室保藏的交沙霉素产生菌那波链霉菌交沙霉素变种（Streptomycesnarbonensis var.Josamyceticus）JM6、JM8、JM14、JM30和JM310菌株进行活化、摇瓶发酵和传代稳定性试验,确定遗传性能较为稳定的JM8（9.3μg/mL）为诱变育种的出发菌株。对JM8菌株进行氯化锂-紫外线诱变育种,结合链霉素抗性平板筛选,获得比出发菌株JM8效价分别提高9.32倍和6.34倍的菌株UV90（96.0μg/mL）和UV50（68.3μg/mL）,对UV90进行60Co-γ射线辐射诱变,所得诱变菌株效价不高且易发生回复突变,未能筛选到高产菌株。对氯化锂-紫外线诱变获得的另一高产菌株UV50（68.3μg/mL）进行分离复壮,获得一株效价较高、遗传性能较为稳定的菌株UV50-20（70.7μg/mL）。以UV50-20为出发菌株,探索菌龄和溶菌酶浓度、酶解时间及酶解温度对原生质体形成和再生的影响,确定制备原生质体的适宜条件为:选用种子液中培养34小时的菌丝体,在4mg/mL的溶菌酶浓度下,于32℃水浴中酶解90min。对菌株UV50-20进行了原生质体再生筛选,获得了遗传性能较为稳定的菌株Y19（0μg/mL）和效价比UV50-20提高1.22倍的菌株Y13（157.3μg/mL）;对Y13进行原生质体-紫外线诱变,得到比Y13效价提高15.89%的菌株YU15（182.3μg/mL）。通过紫外灭活YU15原生质体,并与Y19原生质体融合筛选得到一株比亲本菌株效价提高17.72%的融合子R29菌株（214.6μg/mL）。传代试验表明菌株JM8、UV50、UV50-20、Y19、Y13、YU15和R29传代均比较稳定。利用SAS软件以菌株R29为试验菌株进行了发酵培养基配方的优化研究。首先,采用Plackett-Burman设计法法筛选出影响R29发酵合成交沙霉素的主要因素为棉籽饼粉和豆油,继而利用最陡爬坡路径试验找到试验中心点,综合中心组合设计和响应面分析法确定主要因素的最佳浓度。试验发现采用1.9%棉籽饼粉和0.41%豆油,交沙霉素生物发酵效价达到最大值550μg/mL,比优化前的原始配方提高10.66%。另外,对菌株JM8和菌株R29发酵过程中的菌丝湿重、滤速、糖含量、铵离子含量及效价进行了测定,为交沙霉素工业发酵提供参考指标。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 1 前言
• 1.1 交沙霉素的产生菌
• 1.2 交沙霉素的基本性质
• 1.2.1 交沙霉素的理化性质
• 1.2.2 交沙霉素的抗菌活性和特点
• 1.3 交沙霉素的合成和化学改造
• 1.3.1 交沙霉素的全合成
• 1.3.2 交沙霉素的生物合成
• 1.3.3 交沙霉素的化学改造
• 1.4 交沙霉素的作用机理和临床应用
• 1.4.1 交沙霉素的作用机理
• 1.4.2 交沙霉素的临床应用
• 1.5 交沙霉素的定量检测方法
• 1.5.1 微生物检定法
• 1.5.2 高效液相色谱法
• 1.5.3 分光光度法
• 1.6 交沙霉素的产销现状
• 1.7 抗生素产生菌育种的研究
• 1.7.1 常规诱变育种
• 1.7.2 原生质体技术育种
• 1.8 本试验研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.1.1 生产菌株
• 2.1.1.2 生物测定指示菌
• 2.1.2 培养基
• 2.1.2.1 斜面培养基
• 2.1.2.2 改良高氏培养基
• 2.1.2.3 摇瓶种子培养基
• 2.1.2.4 发酵培养基
• 2.1.2.5 原生质体再生培养基
• 2.1.2.6 生物测定培养基
• 2.1.2.7 琼脂移块法产素专用培养基
• 2.1.3 试剂
• 2.1.3.1 参考品
• 2.1.3.2 酶制剂
• 2.1.3.3 微量元素溶液
• 2.1.3.4 TES缓冲液
• 2.1.3.5 高渗缓冲液（P缓冲液）
• 2.1.3.6 溶菌酶缓冲液
• 2.1.3.7 DNS溶液
• 2.1.3.8 硝普钠
• 2.1.3.9 碱液
• 2.1.4 试验仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 培养条件
• 2.2.1.1 斜面菌种培养条件
• 2.2.1.2 摇瓶种子培养条件
• 2.2.1.3 发酵条件
• 2.2.1.4 原生质体再生培养条件
• 2.2.2 分析方法
• 2.2.2.1 生物效价的测定
• 2.2.2.2 化学效价的测定
• 2.2.2.3 菌丝量的测定
• 2.2.2.4 发酵液中还原糖和总糖浓度的测定
• 4⁺态氮浓度的测定'>2.2.2.5 发酵液中NH₄⁺态氮浓度的测定
• 2.2.2.6 发酵液滤速的测定
• 2.2.2.7 初筛（琼脂移块法）
• 2.2.2.8 复筛（摇瓶发酵）
• 2.2.2.9 终筛（ HPLC法）
• 2.2.3 诱变处理方法
• 2.2.3.1 斜面菌种的制备
• 2.2.3.2 孢子悬液的制备
• 2.2.3.3 幼嫩菌丝体悬液的制备
• 2.2.3.4 原生质体悬液的制备
• 2.2.3.5 原生质体再生率的计算
• 2.3 高产菌株的选育
• 2.3.1 出发菌株的选择
• 2.3.2 紫外线-氯化锂复合诱变
• 60Co-γ射线辐射诱变'>2.3.3⁶⁰Co-γ射线辐射诱变
• 2.3.4 原生质体再生菌株筛选
• 2.3.5 原生质体-紫外复合诱变
• 2.3.6 原生质体融合
• 2.3.6.1 原生质体单亲本紫外灭活
• 2.3.6.2 原生质体双亲本融合
• 2.4 发酵培养基的优化
• 2.4.1 Placket-Burman设计
• 2.4.2 最陡爬坡试验
• 2.4.3 中心组合设计和响应面分析
• 2.4.4 验证性试验
• 2.5 菌株发酵参数的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 交沙霉素生物测定方法研究的结果
• 3.1.1 标准曲线的绘制
• 3.1.2 发酵液浸提溶剂的选择
• 3.1.3 初筛营养菌块的贴放方法的确定
• 3.2 出发菌株的选择
• 3.3 预萌发孢子悬液的氯化锂-紫外诱变
• 3.3.1 紫外线照射不同时间的诱变效果比较
• 3.3.2 硫酸链霉素最小抑制浓度的确定
• 3.3.3 紫外诱变菌株的筛选
• 60Co-γ射线对菌株UV90的诱变'>3.4⁶⁰Co-γ射线对菌株UV90的诱变
• 3.4.1 不同辐照剂量下的诱变效果比较
• 60Co-γ射线诱变菌株复筛'>3.4.2⁶⁰Co-γ射线诱变菌株复筛
• 3.5 原生质体技术
• 3.5.1 出发菌株的复壮
• 3.5.2 原生质体的制备和再生
• 3.5.2.1 交沙霉素产生菌的菌丝生长曲线
• 3.5.2.2 溶菌酶量对原生质体形成和再生的影响
• 3.5.2.3 酶解时间及温度对原生质体形成和再生的影响
• 3.5.3 原生质体再生菌株的筛选
• 3.5.3.1 原生质体再生菌落初筛突变频率分布统计
• 3.5.3.2 原生质体再生菌株的复筛
• 3.5.4 原生质体紫外诱变菌株的筛选
• 3.5.4.1 不同诱变剂量下的诱变效果比较
• 3.5.4.2 原生质体紫外诱变初筛突变频率分布统计
• 3.5.4.3 原生质体紫外诱变菌株的复筛
• 3.5.5 原生质体融合筛选
• 3.5.5.1 融合亲本的选择
• 3.5.5.2 紫外灭活剂量的确定
• 3.5.5.3 融合子的计算
• 3.5.5.4 原生质体融合后再生菌落的筛选
• 3.6 传代稳定性试验
• 3.7 发酵培养基的优化
• 3.7.1 Pluekett-Burman试验设计结果
• 3.7.2 最陡爬坡试验结果
• 3.7.3 中心组合设计及响应面试验设计结果
• 3.7.4 验证性试验结果
• 3.8 菌株JM8和R29发酵代谢曲线的测定
• 3.8.1 葡萄糖溶液吸光度标准曲线的制定
• 4⁺吸光度标准曲线的制定'>3.8.2 NH₄⁺吸光度标准曲线的制定
• 3.8.3 发酵过程中代谢曲线测定结果
• 3.8.3.1 原始出发菌株发酵代谢曲线的初步测定
• 3.8.3.2 诱变菌株发酵代谢曲线的测定
• 4 讨论
• 4.1 快速筛选方法的建立
• 4.2 传统诱变方法和原生质体技术诱变方法的比较
• 4.3 原生质体技术育种的研究
• 4.4 发酵条件优化的研究
• 参考文献
• 致谢