论文摘要
第一部分血管紧张素（1-7）对5/6肾切除大鼠的保护作用目的：ACE2-血管紧张素（1-7）-Mas轴具有对抗肾素-血管紧张素系统,抗增生和抗纤维化特性。本研究拟观察血管紧张素（1-7）单独或联合ARB药物对5/6肾切除大鼠肾脏的保护作用。方法：1.雄性SD大鼠行Sham和5/6肾切除手术。分组：假手术组（Sham组,n=6）、5/6肾切除组（Nx组,n=6）、血管紧张素（1-7）治疗组（Ang（1-7）组,24μg/kg/h,皮下微泵埋置,n=6）、Ang（1-7）+氯沙坦治疗组（A+L组,n=6）和氯沙坦治疗组（Losartan组,10mg/kg/d灌胃,n=6）。8周后测大鼠尾动脉血压及收集24小时尿液检测尿蛋白,检测Scr水平和RIA法检测血浆Ang和Ang（1-7）含量。2.PAS染色观察肾脏病理变化；免疫组化检测肾小球硬化指标Fibronectin（FN）和Collagen I （Col I）的表达；DCFDA法检测肾组织ROS产物的表达。3. Real-time PCR检测Mas受体和PAI-1mRNA水平；Western blot法检测肾组织FN、血管生成素（Ang）-Tie-2以及p47-phox和p67-phox的表达水平。结果：Ang（1-7）组、Losartan组和A+L组均可改善Nx组大鼠尿蛋白、血肌酐水平,升高血浆Ang（1-7）含量,减轻肾小球的硬化程度,降低肾小球硬化指标（FN、PAI-1和Col Ⅰ）和ROS表达以及NADPH氧化酶（p47-phox和p67-phox）活性。Ang（1-7）组改善尿蛋白、血.肌酐、硬化指标作用弱于A+L组和Losartan组,对血压、Ang-1/Ang-2比值无影响。Losartan组显著升高血浆AngⅡ水平,对Ang-1/Ang-2比值无影响。A+L组改善5/6肾切除大鼠肾损伤较Ang（1-7）组和Losartan组更显著。结论Ang（1-7）具有拮抗Ang II的作用而改善5/6肾切除大鼠肾损伤,Ang（1-7）和氯沙坦双向阻断Angll的作用,对延缓慢性肾脏疾病的进展有更好的保护作用。第二部分Ang（1-7）对AngⅡ诱导系膜细胞纤连蛋白表达的影响目的：Ang（1-7）在肾小球固有细胞如系膜细胞中抗纤维化作用尚不明确。本研究拟观察Ang（1-7）对抗Ang Ⅱ诱导系膜细胞FN的表达及其具体机制。方法：1.体外培养小鼠系膜细胞,应用Western blot方法观察Ang（1-7）处理AngⅡ诱导细胞后FN表达情况以及Losartan阻断AT1同时给予Ang（1-7）后FN表达情况。2.体外培养小鼠系膜细胞,细胞生长融合至50%时,向6孔板中分别转入500nM Mas特异性干扰RNA （Mas siRNA）和空载对照干扰RNA （Vehicle siRNA）,处理24小时后,根据不同分组,分别向6孔板中加入Ang（1-7）、AngⅡ和DX-600,应用Western blot和Real-time PCR方法检测FN的表达的情况。3.体外培养小鼠系膜细胞,应用免疫共沉淀法观察细胞转染Vehicle siRNA和Mas siRNA后,AT1和Mas的表达情况以及两者相互关系。结果：1.Ang（1-7）对AngⅡ诱导系膜细胞FN蛋白表达增多无影响。2. Mas siRNA干扰Mas表达或给予DX-600减少Ang（1-7）的生成均可明显增加Ang Ⅱ诱导细胞FN的表达（P<0.05）。3.在无外源性Ang Ⅱ的情况下,Ang（1-7）本身较对照组FN表达无差异,而阻断AT1后,Ang（1-7）显著减少FN的表达（P<0.05）。4.AT1与Mas之间可形成复合物的中间状态。结论：在无外源性Ang Ⅱ的情况下,Ang（1-7）拮抗Ang Ⅱ诱导FN表达,而Ang（1-7）对外源性Ang Ⅱ诱导系膜细胞FN表达增多无影响,可能与两者受体之间形成AT1-Mas复合物中间状态的解离有关。第三部分Ang（1-7）对肾小球血管生成素-Tie-2系统的影响及机制研究目的：血管生成素-Tie-2系统为肾小球固有细胞（内皮细胞,足细胞）特有的血管生成系统之一。Ang（1-7）具有抑制血管生成的作用,而此效应在肾小球细胞中未见报道。本研究拟观察Ang（1-7）对肾小球血管生成素-Tie-2系统的影响及其可能机制。方法：1.体外培养小鼠肾内皮细胞,运用Matrigel凝胶法观察内皮细胞管腔形成能力。2.体外培养小鼠足细胞和内皮细胞,运用Real-time PCR法检测不同剂量Ang（1-7）或Ang Ⅱ对足细胞表达Ang-1和内皮细胞表达Ang-2的影响。3.体外培养小鼠足细胞和内皮细胞,在无或有外源性AngⅡ的情况下,根据不同分组,分别给予Ang （1-7）、Losartan、Mas受体阻断剂A-779和ERK1/2阻断剂PD98059,运用Western blot法检测Ang-1、Ang-2及受体Tie-2表达以及eNOS磷酸化、ERK1/2磷酸化水平。结果：1.在无外源性Ang Ⅱ条件下,Losartan能协同Ang（1-7）抑制血管生成素-Tie-2的表达。在有外源性Ang Ⅱ条件下,Ang（1-7）抑制血管生成素-Tie-2的表达更显著（P<0.05）, Losartan、A-779和PD98059能逆转Ang（1-7）对血管生成素-Tie-2的表达的抑制作用（P<0.05）。2.Ang（1-7）本身激活eNOS信号通路（P<0.05）；在有外源性Ang Ⅱ条件下,Ang（1-7）致内皮细胞eNOS磷酸化显著减少,ERK1/2磷酸化明显增加,而给予NO合成酶抑制剂L-NAME,增加的ERK1/2磷酸化受到明显抑制（P<0.05）。结论：Ang（1-7）本身抑制血管生成,对抗内源性Ang Ⅱ促生长作用；Ang（1-7）与外源性Ang Ⅱ共同作用,通过下调eNOS而激活ERK1/2信号通路显著下调血管生成素-Tie-2的表达,协同抑制内皮细胞生长,Losartan能逆转此效应。