橡胶胶乳特异表达锌指蛋白基因分离、克隆及表达分析

论文摘要

天然橡胶是产胶植物的一种次生代谢物,它具有耐高温、高弹性等突出优点,是合成橡胶不可比拟的一种世界性工业原料和重要的战略物资,具有极高的经济价值及应用前景。天然橡胶主要来源于大戟科的巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）,目前有关巴西橡胶树形态、产胶生理及栽培学等方面的研究已取得了较大的进展,产胶量也达到了一定的水平。但随着对天然橡胶需求的日益增长,如何进一步提高橡胶树的产胶量已成为天然橡胶行业亟待解决的重大课题,尤其在传统的技术与方法基础上,急待探索提高胶乳产量的新途径。胶乳里存在着特异表达的基因,其中包括一些转录调控因子,它们与橡胶生物合成和植物抗逆等密切相关。本研究旨在分离与克隆这些特异表达的转录调控因子,并研究它们在不同激素处理下的表达情况,为探究其与橡胶合成相关基因之间的调控关系奠定基础。这对于进一步阐明橡胶生物合成的分子机制具有重要的意义,同时还能为橡胶树转基因高产抗逆育种的研究提供材料和理论依据。本研究通过对橡胶叶与胶乳mRNA的提取,对其逆转录产物cDNA经Cy3、Cy5荧光染料标记后,进行芯片杂交,杂交数据结果显示,在橡胶胶乳中上调表达显著的基因共有105个,其中上调表达达极显著的基因有44个,包括elongationfactor Tu（延伸因子基因）,thioredoxin H-type 1（硫氧还蛋白H型1基因）,zinc finger （C3HC4-type RING finger） family protein（锌指蛋白基因）等。在橡胶叶中表达显著的基因共有151个,其中表达极显著的有34个。经过生物信息学分析后选择了四个锌指蛋白基因（其中包括一个胶乳特异表达的锌指蛋白基因）作为研究对象。我们对这四个基因分别在橡胶树cDNA和基因组DNA中进行了克隆,分析了其内含子分布情况；并通过荧光定量PCR研究其在外施五种激素的条件下的胶乳中的表达谱。通过定量PCR结果分析发现,四个锌指蛋白基因受ABA（脱落酸）、ethylene（乙烯）、JA（茉莉酸）、SA（水杨酸）的正调控,而受2,4-D负调控；且基因表达呈现周期性变化的趋势,但上下波动的幅度是否随时间延长而减弱,这一点还有待进一步研究。在五种激素中,四个锌指蛋白基因对JA的刺激最为敏感,一经JA刺激便立刻表现为明显的上调表达反应。通过对五种激素刺激下橡胶转移酶基因的表达模式的研究,发现其表达模式与四个锌指蛋白在对应的激素刺激下的表达模式类似,说明橡胶转移酶基因可能受锌指蛋白基因调控。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 橡胶生物合成分子生物学研究进展
• 1.1.1 橡胶生物合成分子生物学研究现状与不足
• 1.1.2 激素对橡胶生物合成的调控及其分子生物学研究现状与不足
• 1.1.3 橡胶转录因子研究现状与分析
• 1.1.4 植物锌指蛋白与橡胶胶乳产生的关联性分析
• 1.2 差异表达基因的筛选技术
• 1.2.1 mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）
• 1.2.2 RNA随机引物聚合酶链式反应（RAP-PCR）
• 1.2.3 代表性差异分析（cDNA-RDA）
• 1.2.4 抑制消减杂交（SSH）
• 1.2.5 cDNA微阵列在检测表达差异基因中的应用
• 1.2.6 基因表达序列分析（SAGE）
• 1.3 应用拟南芥cDNA微阵列芯片研究非模式植物的转录谱
• 1.4 锌指蛋白的研究进展
• 1.4.1 锌指蛋白的结构
• 1.4.2 锌指蛋白的分类
• 1.4.3 锌指蛋白转录因子的调控机理
• 1.4.4 与逆境胁迫相关的植物锌指蛋白
• 1.4.4.1 与盐胁迫有关的锌指蛋白
• 1.4.4.2 与冷胁迫有关的锌指蛋白
• 1.4.4.3 与干旱胁迫有关的锌指蛋白
• 1.4.4.4 与氧胁迫有关的锌指蛋白
• 1.4.4.5 与强光胁迫有关的锌指蛋白
• 1.5 本研究的目的和意义
• 1.6 技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料来源
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 生化试剂
• 2.1.3.1 质粒载体
• 2.1.3.2 工具酶及分子量标准
• 2.1.3.3 试剂盒
• 2.1.3.4 主要化学试剂
• 2.1.4 芯片选择
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.1.6 引物列表
• 2.2 方法
• 2.2.1 利用cDNA微阵列筛选差异表达基因
• 2.2.1.1 胶乳RNA的提取
• -A⁺提取叶片总RNA'>2.2.1.2 CTAB结合TRNzol^-A⁺提取叶片总RNA
• 2.2.1.3 RNA纯化
• 2.2.1.4 RNA的琼脂糖凝胶电泳检测
• 2.2.1.5 总RNA的浓度检测
• ?cRNA扩增标记试剂盒)'>2.2.1.6 对样品RNA进行荧光标记(晶芯^?cRNA扩增标记试剂盒)
• 2.2.1.7 杂交与清洗
• 2.2.1.8 芯片扫描
• 2.2.1.9 芯片图像的采集与数据分析
• 2.2.1.10 生物信息学分析
• 2.2.2 橡胶C3HC4型锌指蛋白基因的克隆
• 2.2.2.1 橡胶基因组DNA的提取
• 2.2.2.2 cDNA第一链合成
• 2.2.2.3 PCR
• 2.2.2.4 PCR产物的回收与纯化
• 2.2.2.5 载体连接
• 2.2.2.6 重组质粒的转化
• 2.2.2.7 菌落PCR检测
• 2.2.3 激素处理后的表达分析
• 2.2.3.1 实验材料处理
• 2.2.3.2 胶乳RNA的提取
• 2.2.3.3 RT-PCR
• 2.2.3.4 Real-Time PCR
• 3. 结果与分析
• 3.1 胶乳特异表达基因的获得
• 3.1.1 胶乳RNA和叶片RNA的提取
• 3.1.2 基因芯片表达谱
• 3.1.3 芯片杂交结果
• 3.1.4 芯片结果分析
• 3.2 四个锌指蛋白基因的克隆
• 3.2.1 基因组DNA的质量检测
• 3.2.2 基因克隆
• 3.2.3 内含子分析
• 3.3 四个锌指蛋白基因在激素刺激下的表达差异分析
• 3.3.1 RNA质量检测
• 3.3.2 real-time PCR结果
• 3.4 锌指蛋白基因与橡胶转移酶基因的关联性分析
• 4. 讨论
• 4.1 微阵列杂交种关键技术问题及解决方法
• 4.1.1 29k Aabidopsis Genome Array芯片说明
• 4.1.2 芯片质量控制
• 4.1.3 对弱杂交信号的处理
• 4.1.4 芯片假阳性问题的处理
• 4.2 微阵列杂交结果对研究橡胶代谢合成途径的价值
• 4.3 橡胶DNA、RNA的提取
• 4.4 关于荧光定量PCR的实验
• 4.5 cDNA质量的检测
• 4.6 关于激素作用下锌指蛋白的功能
• 5. 结论
• 参考文献
• 缩略词表
• 附录
• 致谢