论文摘要
目的为建立以磁分离技术为核心的分离系统，摸索制备具有非特异吸附性能的裸磁珠及其包被的条件，为下一阶段免疫磁珠的制备奠定基础。同时建立以蜡样芽胞杆菌为代表的芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群细菌的TaqMan实时荧光PCR快速检测方法，并对该方法进行了初步的优化、评价及应用。方法本研究分为两部分内容：1裸磁珠的制备及包被1．1磁珠的制备Fe2+和Fe3+分别与OH离子反应生成Fe（OH）2和Fe（OH）3，Fe（OH）2和Fe（OH）3不稳定，分别降解生成FeO和Fe2O3，即最后生成了Fe3O4。用蒸馏水洗涤磁珠至中性，并用磁分离架进行分离。1．2磁珠的包被以1％的醋酸溶解壳聚糖，将壳聚糖包被于制备好的裸磁珠表面后，进而再包被上作为交联剂的戊二醛。2 TaqMan实时荧光PCR快速检测芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群细菌方法的建立通过比较大量芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群细菌的特异性基因，最终选择ITS基因作为检测的目的片段。从GenBank中下载ITS基因序列并进行同源性比较，选择保守区段进行引物和探针的设计。对比CTAB法和硅胶模型基因组DNA提取法两种DNA提取方法，选取实时荧光PCR快速检测方法建立初期，合适的DNA标准制备方法。同时，通过优化引物浓度、退火温度、探针浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq酶浓度以及缓冲液浓度，以建立起TaqMan实时荧光PCR快速检测芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群细菌的方法。最后，检验该方法的灵敏度和特异性，并对模拟样品进行了检测。结果1磁珠的制备和包被成功制备出裸磁珠，经透射电镜观察，裸磁珠直径达到纳米级，制备的磁珠在溶液中悬浮性较好，在磁场的作用下可较好的分离该磁性微粒。壳聚糖溶解于1％醋酸后用于包被制备的磁珠，包被磁珠体积增大，可用于连接抗体，为后续免疫磁珠的制备奠定了基础。2选取16S-23S rDNA基因间区序列作为目的基因设计引物和探针如下：上游引物：5′-GAGTCCATTTAGGCCCACCATAC-3′下游引物：5′-AGCTTGGCGACTGGAGGACGC-3′TaqMan探针：5′-FAM-CAAGGCAGGCGCTCTCCCAGCTGAG-TAMRA-3′经过优化，成功建立了以蜡样芽胞杆菌为代表的芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群TaqMan实时荧光PCR的快速检测方法，优化后的反应体系如下表所示。并通过比较，最终选取硅胶模型基因组DNA提取法，成功制备了该检测方法的DNA初标准。同时该方法的评测结果显示，该方法的检测灵敏度达到172fg，菌液灵敏度达到22cfu／反应体系；且该方法特异性较好，可同时检测包括蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌在内的4种芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群细菌。结论本研究为建立常见食源性病原菌快速检测系统，在分离手段上成功制备了纳米级的裸磁珠和包被磁珠，为下一步免疫磁珠的建立奠定了良好的基础。同时，成功建立了芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群TaqMan实时荧光PCR快速检测方法，为芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群细菌引起的食物中毒检测提供了又一灵敏、特异的方法。
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