重组草鱼PACAP38的高效表达、分离纯化及其生物活性的研究

论文摘要

垂体腺苷酸环化酶激活多肽（Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide, PACAP）是促胰液素/胰高血糖素家族的成员,它在脊椎动物的中枢神经系统和外周组织中发挥着多种生理功能。PACAP能有效地促进鱼类生长激素（Growth hormone, GH）和促性腺激素（Gonadotropin, GTH）的分泌,进而调节鱼类的生长和生殖。近年来,PACAP38作为新型生长激素释放因子（growth hormone-releasing factor, GRF）在鱼类研究中受到越来越多的关注。本研究旨在建立大规模制备低成本、高活性的草鱼PACAP38的方法。根据大肠杆菌密码偏好性设计了3条寡核苷酸片段,并用两步PCR的方法合成草鱼PACAP38的开放性阅读框（open reading frame,ORF）,分别克隆至pThioHis A和pET32a（+）载体,构建Top10-pThioHis A-PACAP38、BL21（DE3）-pThioHis A-PACAP38和BL21（DE3）-pET32a（+）-PACAP38三种表达系统,其中BL21（DE3）- pET32a（+）-PACAP38为最佳表达系统。用该表达系统大规模制备的Thioredoxin-PACAP38(Trx-PACAP38)融合蛋白85%以上为可溶性蛋白,融合蛋白占可溶性总蛋白的36%;1L E.coli BL21（DE3）菌液中含有123 mg Trx-PACAP38融合蛋白,经Ni2+亲和层析柱纯化获得99 mg 97%纯度的Trx-PACAP38融合蛋白。与融合伴侣对照组相比较,纯化得到的Trx-PACAP38融合蛋白能特异性抑制T98G人胶质瘤细胞的增殖,而PACAP抗体能中和该效应,证明重组草鱼PACAP38具有抑制肿瘤细胞增殖的生物学活性。本研究成功建立了一种表达和纯化重组草鱼PACAP38的方法,可以为一些重要小肽的生产提供借鉴。纯化获得的重组草鱼PACAP38不仅有助于鱼类养殖,而且有助于鱼类生长与生殖功能的基础性研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 本课题研究意义
• 1.2 国内外研究概况
• 1.2.1 PACAP 分子结构、基因及进化
• 1.2.1.1 PACAP 基因
• 1.2.1.2 PACAP 分子结构与进化
• 1.2.2 PACAP 的组织分布
• 1.2.3 PACAP 的受体及其分布
• 1.2.4 PACAP 的作用机理
• 1.2.5 PACAP 的结构与功能的关系
• 1.2.6 PACAP 生物功能
• 1.2.6.1 下丘脑促垂体激素功能
• 1.2.6.2 在生殖系统中的作用
• 1.2.6.3 在心血管系统中的作用
• 1.2.6.4 在消化系统中的作用
• 1.2.6.5 在神经系统中的作用
• 1.2.6.6 在免疫系统中的作用
• 1.3 本课题研究内容
• 38表达载体的构建及其融合蛋白的表达和纯化'>第二章 草鱼PACAP₃₈表达载体的构建及其融合蛋白的表达和纯化
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和载体
• 2.1.2 引物
• 2.1.3 主要溶液配制
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要仪器和设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 聚合酶链反应（PCR）及扩增产物的胶回收纯化
• 2.2.2 胶回收纯化产物和载体的酶切
• 2.2.3 回收片段连接反应
• 2.2.4 E.coli 感受态的制备
• 2.2.5 质粒DNA 的抽提与转化
• 2. 2.5.1 质粒DNA 的抽提
• 2.2.5.2 转化
• 2.2.6 重组质粒的诱导表达
• 2.2.6.1 优化诱导表达条件
• 2.2.6.2 蛋白质浓度测定
• 2.2.6.3 Western-blot 鉴定
• 2.2.7 融合蛋白的纯化
• 2.2.8 pET32a（+）空载体的诱导表达与纯化
• 2.3 结果
• 38 在Top10 中表达和纯化'>2.3.1 pThioHis A/PACAP₃₈ 在Top10 中表达和纯化
• 38 表达质粒的构建和鉴定'>2.3.1.1 pThioHis A/PACAP₃₈表达质粒的构建和鉴定
• 38 质粒的诱导表达和条件优化'>2.3.1.2 pThioHis A/PACAP₃₈质粒的诱导表达和条件优化
• 38 融合蛋白的纯化'>2.3.1.3 Trx-PACAP₃₈融合蛋白的纯化
• 38 在BL21（DE3）中表达和纯化'>2.3.2 pThioHis A/PACAP₃₈在BL21（DE3）中表达和纯化
• 38 质粒的诱导表达和条件优化'>2.3.2.1 pThioHis A/PACAP₃₈质粒的诱导表达和条件优化
• 2.3.2.2 Trx-PACAP 融合蛋白的纯化
• 38 在BL21（DE3）中表达和纯化'>2.3.3 pET32a（+）/PACAP₃₈在BL21（DE3）中表达和纯化
• 38 表达质粒的构建和鉴定'>2.3.3.1 pET32a（+）/PACAP₃₈表达质粒的构建和鉴定
• 38 质粒的诱导表达和条件优化'>2.3.3.2 pET32a（+）/PACAP₃₈质粒的诱导表达和条件优化
• 38 融合蛋白的纯化与鉴定'>2.3.3.3 Trx-PACAP₃₈融合蛋白的纯化与鉴定
• 2.3.4 融合伴侣的表达和纯化
• 2.4 讨论
• 38 重组质粒的构建和原核表达'>2.4.1 PACAP₃₈重组质粒的构建和原核表达
• 38 融合蛋白的纯化'>2.4.2 Trx-PACAP₃₈融合蛋白的纯化
• 38的生物学活性的确定'>第三章 草鱼重组PACAP₃₈的生物学活性的确定
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 细胞株
• 3.1.2 主要试剂及其配制
• 3.1.3 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 T98G 人胶质瘤细胞的培养
• 38 融合蛋白对T98G 人胶质瘤细胞增殖的影响'>3.2.2 不同时间条件下Trx-PACAP₃₈ 融合蛋白对T98G 人胶质瘤细胞增殖的影响
• 38 融合蛋白对T98G 人胶质瘤细胞增殖的影响'>3.2.3 不同剂量Trx-PACAP₃₈ 融合蛋白对T98G 人胶质瘤细胞增殖的影响
• 38 融合蛋白的免疫中和对人胶质瘤细胞增殖的影响'>3.2.4 Trx-PACAP₃₈融合蛋白的免疫中和对人胶质瘤细胞增殖的影响
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 第四章 结束语
• 致谢
• 参考文献
• 攻硕期间取得的研究成果