长距离实时定量PCR技术检测斑马鱼DNA损伤的研究

论文摘要

DNA损伤作为检测疾病和环境污染物毒性的一个重要指标,一直以来都是研究的重点和难点。通过长片段DNA（10Kb以上）PCR扩增的方法反应DNA损伤程度的研究已有报道,它的原理就是受损伤的DNA会阻断DNA的扩增。本论文将长片段DNA PCR技术与实时定量PCR方法相结合,建立了长距离实时定量PCR（long-amplication real time PCR,LA-real time PCR）技术。同时,我们将环境化合物BaP和TBBPA通过腹腔注射成年雄性斑马鱼和体外暴露斑马鱼受精卵的方式,从DNA损伤和形态观察（心搏率、孵化率）两个层面研究这两种污染物对模式生物斑马鱼及其胚胎的致毒机制。此外,将提取出的斑马鱼DNA直接暴露于紫外线,通过LA-real time PCR技术分别研究三种方式处理下,斑马鱼线粒体DNA和核DNA的受损伤情况。本研究结果可以为检测环境污染物和临床疾病的检测提供理论依据。研究取得的结果如下:（1）DNA直接暴露于紫外线的实验表明当DNA受到物理因素-紫外线照射的时候,能够引起DNA的损伤,且受损伤的程度与所暴露的紫外强度存在明显的剂量效应,即紫外强度越大,DNA受损伤程度也越大,且当紫外线强度达到40J/M2时,DNA基本不存在完整的链,PCR反应也基本被阻断,说明用LA-real time PCR技术可以检测出DNA受损伤的程度。（2）污染物处理成年雄性斑马鱼的实验表明斑马鱼对本实验所选择的污染物十分敏感,BaP（1、10μg/g）和TBBPA（10、100μg/g）均能使斑马鱼脑、鳃、精巢和肌肉四个组织的DNA受到损伤,从而阻断PCR的扩增。从结果可以看出在两种浓度BaP和TBBPA处理下,四个组织的线粒体DNA均有损伤,但在24h、48h和96h其DNA受损伤的程度却不相同,且高浓度和低浓度处理下也没有规律性的变化,因此并不存在剂量-时间效应,而这一相同的现象也出现在核DNA的损伤结果中。但两种污染物相比,TBBPA处理组其DNA的损伤程度要小于BaP组。（3）胚胎暴露实验发现两种环境污染物会对斑马鱼的胚胎造成极显著的损伤（P<0.01）,且TBBPA处理下的线粒体DNA与核DNA受损伤程度与其暴露浓度有关,即存在剂量效应,而在BaP处理组,却没有这种关系。同时胚胎组的线粒体DNA对污染物的敏感性普遍比核DNA低。（4）在形态观察方面,可以看到经处理过的胚胎发育过程中会形成心包囊水肿、脊柱弯曲和尾部发育不全等现象,且在胚胎发育前期,更容易出现胚胎死亡现象,心搏率测试显示经Ba P处理过后48h胚胎的心搏率均无显著变化,而在10μg/L和20μg/L BaP的72h和96h处理下,胚胎的心搏率受到显著的抑制,4μg/L处理下只在96h有显著降低,这说明BaP与胚胎心搏率之间存在着剂量-时间效应。而在TBBPA处理组,0.75mg/L 48h、72h和96h、1.5mg/L 48h和72h以及5mg/L 48h处理下,斑马鱼胚胎心搏率不但没有受到抑制,反而起到了极显著的促进作用（P<0.01）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 引起DNA损伤的原因及DNA损伤的类型
• 1.1.1 引起DNA损伤的因素
• 1.1.2 DNA损伤的不同类型
• 1.2 实时荧光定量PCR技术概述
• 1.2.1 长距离实时定量PCR技术概括
• 1.2.2 LA-real time PCR技术的关键
• 1.2.3 DNA模板
• 1.2.4 DNA聚合酶
• 1.2.5 荧光染料
• 1.2.6 引物
• 1.2.7 数据分析
• 1.3 PCR技术在DNA损伤研究中的应用
• 1.4 实验生物及目的基因片段的选择
• 1.5 实验涉及的环境污染物的研究现状
• 1.5.1 苯并（a）芘的理化性质及污染现状
• 1.5.2 四溴双酚A化合物的污染现状及毒理学研究
• 1.5.3 BaP和TBBPA的致毒机制
• 1.6 研究内容和技术路线
• 1.6.1 研究内容
• 1.6.2 技术路线
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要仪器与试剂
• 2.1.3 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 斑马鱼养殖
• 2.2.2 总DNA的提取和去除RNA的污染
• 2.2.3 线粒体基因片段的扩增
• 2.2.4 染料筛选
• 2.2.5 毒理实验
• 2.2.6 形态观察
• 第3章 结果
• 3.1 总DNA的抽提结果
• 3.2 PCR扩增结果
• 3.2.1 XL-NC002333 PCR扩增结果
• 3.2.2 SM-NC002333 PCR扩增结果
• 3.2.3 XL-BX908726.21 PCR扩增结果
• 3.2.4 SM-BX908726.21 PCR扩增结果
• 3.3 荧光染料的筛选
• 3.4 real-time PCR得到的各片段的扩增效率
• 3.4.1 LA-real time PCR扩增得到的XL-NC002333的扩增效率
• 3.4.2 real-time PCR扩增得到的sm-NC002333的扩增效率
• 3.4.3 LA-real time PCR扩增得到的XL-BX908726.21的扩增效率
• 3.4.4 real-time PCR扩增得到的SM- BX908726.21的扩增效率
• 3.5 紫外线照射对离体斑马鱼DNA的损伤情况
• 3.6 BAP对斑马鱼不同组织核DNA和线粒体DNA的影响
• 3.6.1 BAP对斑马鱼不同组织核DNA的影响
• 3.6.2 经BAP处理后斑马鱼线粒体DNA链的完整性
• 3.7 TBBPA暴露对斑马鱼DNA的影响
• 3.7.1 经TBBPA处理后斑马鱼核DNA链的完整性
• 3.7.2 经TBBPA处理后斑马鱼线粒体DNA链的完整性
• 3.8 BAP和TBBPA对斑马鱼胚胎的毒性作用
• 3.8.1 BAP和TBBPA对不同发育阶段斑马鱼胚胎心搏率的影响
• 3.8.2 BAP和TBBPA暴露下对斑马鱼胚胎孵化率的影响
• 3.9 BAP和TBBPA对斑马鱼胚胎DNA的影响
• 3.9.1 BAP和TBBPA暴露下斑马鱼胚胎核DNA链的影响
• 3.9.2 BAP和TBBPA暴露下斑马鱼胚胎线粒体DNA链的影响
• 3.9.3 斑马鱼胚胎线粒体和核DNA对BAP和TBBPA的敏感性比较
• 第4章 讨论
• 第5章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 学习期间发表的学术论文