论文摘要
柯萨奇病毒（CV）和人类单纯疱疹病毒（HSV）都是人类病毒性疾病的致病病原,目前国内外治疗单纯疱疹病毒的药物以阿昔洛韦及其衍生物的应用最为广泛,但该类药物存在毒副作用大,价格昂贵等许多不足;到目前为止,国内外还没有较好的针对柯萨奇病毒的治疗药物。我们前期研究发现大黄素具有一定的抗CVB3和HSV-Ⅰ的活性,因此对大黄素进行深入研究。但是大黄素存在一些问题:一是水溶性差;二是存在较高的细胞毒性;三是可能存在疑似的致畸和诱导突变作用。为解决这几个问题,本课题从三个方面着手:第一,根据制剂的原理,用辅料PEG6000将大黄素制备成分散体系;第二,根据中药配伍减毒增效的原理,用姜黄素和苦参碱与大黄素进行配伍,筛选出高效低毒的最佳组合;第三,通过药物有效成分提取工艺的优化,降低整体药物组合的动物毒性。采用正交设计方法,将大黄素、姜黄素、苦参碱三种成分按一定比例进行配伍,以药物抗病毒的治疗指数（TI）为评价指标,比较各组药物的细胞毒性和抗病毒作用的效力,结果显示单纯大黄素对Hep-2细胞的毒性作用最大,通过配伍,细胞毒性可降低10倍左右;所有中药组合都没有阻止CVB3病毒吸附到细胞上的作用,但是对于已经进入细胞内的CVB3病毒的生物合成则都有一定的抑制作用,其中大黄素:姜黄素:苦参碱为2:0:1的这一组TI为最高;各组药物都有直接杀死CVB3病毒的作用,其中TI最高的药物组合是大黄素:姜黄素:苦参碱为2:1:2。辅料既无细胞毒性也无抗病毒的效力,对整个试验不产生影响,阳性对照药物阿昔洛韦既无细胞毒性也无抗病毒的效力。抗HSV-Ⅰ的体外试验选择vero细胞,实验原理和方法与前面一致。结果显示大黄素对vero细胞的毒性作用最大,通过配伍,细胞毒性可降低11倍左右;阻止病毒吸附在细胞上作用最强的药物组合是大黄素:姜黄素:苦参碱为1:2:2与大黄素:姜黄素:苦参碱为2:1:2;直接杀死病毒TI最高的是纯品苦参碱;抑制病毒在细胞内生物合成TI最高的药物组合为大黄素:姜黄素:苦参碱为2:0:1。阳性对照药物阿昔洛韦,没有阻止病毒对细胞的吸附作用,但具有一定的抑制病毒在细胞内生物合成和直接杀死病毒的作用。大黄素经过配伍后三种作用途径都能发挥作用,强于阿昔洛韦。本课题在细胞筛选的基础上,选择4#深入进行了抗CVB3感染小鼠保护作用的研究。首先建立了CVB3感染的小鼠模型,染病小鼠在24h后开始治疗。连续15天灌胃治疗。试验结果显示,经复方大黄素药物组合治疗后的染病小鼠发病症状明显减轻,死亡率下降;治疗组的小鼠心、肺、肾等组织中病毒滴度均低于阳性对照组和模型对照组,说明该组合能抑制CVB3病毒在心、肺、肾等脏器中的增殖;治疗组的小鼠心、肺、肾等组织切片的荧光反应不明显,荧光点显著少于阳性对照组和模型对照组,这也说明该组合对小鼠脏器具有较强的保护作用;从小鼠脏器中提取病毒mRN,PCR扩增凝胶电泳分析中同样可以看出高、中剂量组中没有扩增出病毒DNA,说明病毒在高、中剂量组中得到了抑制。同时试验结果说明CVB3病毒不在肝组织中繁殖增生,肝细胞对该病毒不易感。阳性对照阿昔洛韦没有抗CVB3病毒的作用,也不能保护小鼠免受病毒的侵入。我们比较了大黄素、苦参碱纯品和提取物以及他们的配伍组合的小鼠急性毒性。发现大黄素和苦参碱在高剂量时对小鼠存在较大的急性毒性,但在较低剂量时无影响,提取物的毒性则明显低于纯品,LD50分别提高了3～4倍;并且两种药物成分无论是纯品还是提取物,经过配伍后小鼠的急性毒性显著下降。结果说明,用有效部位提取物代替纯化合物可极大降低药物的整体动物毒性。蓄积毒性试验结果显示复方大黄素组合没有蓄积毒性;孕鼠致畸敏感期试验结果显示,该药物组合在安全剂量内没有致畸的副作用。复方大黄素组合物中,用提取物代替纯化合物可以极大地降低组合物的整体动物毒性,说明提取工艺的不同会导致药物组合的毒性具有差异,因此提供工艺和质量稳定就成了至为关键的一个环节。大黄素的最佳提取工艺为虎杖药材加80%的乙醇回流提取3次,每次8倍量的溶剂提取时间1.5h,得到粗提取物后进行一系列纯化,可得含大黄素提取物;苦参总碱的提取工艺为苦参药材加60%的乙醇回流提取3次,每次6倍量的溶剂,提取时间1.5h,可得苦参总碱粗提取物。利用离子交换树脂法用0.5%的稀盐酸处理苦参总碱,pH值12的氨水碱化,三倍柱体积80%乙醇洗脱得到较纯苦参总碱。采用HPLC测定含量,大黄素的色谱条件为流动相乙腈:0.1%磷酸（80:20）、检测波长254nm,苦参碱的色谱条件为流动相乙腈:无水乙醇:3%磷酸（70:15:15）、检测波长220nm;姜黄素的色谱条件为流动相甲醇:0.6%醋酸（75:25）、检测波长428nm。规定复方大黄素组合物中,含大黄素的提取物中大黄素的含量不低于70%;苦参总碱提取物中苦参碱的含量不低于80%,姜黄提取物中姜黄素的含量不低于80%。本课题研究复方大黄素组合抗CVB3和HSV-Ⅰ病毒的作用,从细胞实验进行各组配方的抗病毒活性筛选,到对感染小鼠进行治疗,再到对感染小鼠进行治疗,以及动物毒性的研究。试验结果显示复方大黄素组合细胞和动物毒性低,抗病毒作用强,是一种比较好的抗病毒药物组方。