斜纹夜蛾幼虫表皮对莱氏野村菌侵染的防御功能研究

论文摘要

昆虫病原真菌是自然界中害虫种群的重要控制因素,体壁侵入是真菌感染昆虫最主要的途径。因此,除病原真菌本身的侵染能力外,昆虫体壁的结构及化学成分直接影响真菌侵染效率。菌株CQNr01是本实验室从罹病斜纹夜蛾僵虫上分离到的一株杀虫真菌,前期的研究显示,该菌株对斜纹夜蛾低龄幼虫有较好的杀虫效果,但对高龄幼虫侵染率较低。为了探索该菌株的开发应用潜力,本课题在对该菌株的生物学特征、培养条件等进行研究的基础上,以不同侵染方式处理斜纹夜蛾不同龄期幼虫,对不同处理下CQNr01菌株对斜纹夜蛾不同龄期幼虫的致病力差异、侵染过程及斜纹夜蛾不同龄期幼虫的表皮脂类对CQNr01菌孢子的萌发影响等做了初步的研究,旨在探究斜纹夜蛾表皮在防御CQNr01菌株侵染中的防御功能及机理,明确病原真菌与斜纹夜蛾的相互作用关系,为害虫生物防治提供理论基础。研究的主要结果如下:观察了菌株的形态和生物学特征,结合ITS序列比对结果,确定该菌株的分类地位为莱氏野村菌（Nomuraea riley）,并命名为菌株CQNr01。通过生物学研究确定了适宜菌株CQNr01生长的基础培养基为SDAY培养基,确定了适合其菌丝生长和产孢的最佳温度为25℃,最适pH值为6.5;还对该菌株的胞外蛋白酶和几丁质酶产生能力做了研究,发现该菌几丁质酶生产能力很差,而25℃时具有较强的蛋白酶生产能力。采用孢子悬浮液浸泡和注射两种方法测定了菌株CQNr01分生孢子对斜纹夜蛾2龄和4龄幼虫的致病力差异。浸泡法处理斜纹夜蛾,1×108孢子·mL-1浓度时2龄和4龄幼虫的死亡率分别为89.98%和13.33%;同浓度的菌悬液进行注射处理,2龄和4龄幼虫的死亡率则分别到达100%和88.89%。证明了高龄幼虫体壁在防御CQNr01侵染中起着决定性的作用。制作不同龄期斜纹夜蛾幼虫离体表皮并接种CQNr01孢子悬浮液,利用荧光显微镜观察和扫描电镜观察孢子萌发和侵染结构产生情况。荧光观察发现,菌株CQNr01的孢子能够成功附着在斜纹夜蛾幼虫的离体表皮上,但孢子在2龄幼虫表皮的粘附能力优于4龄幼虫;接种24h起两个龄期的离体表皮上均开始有孢子萌发现象并有附着胞和芽管产生,并随着接种时间的增长芽管不断伸长,但相同接种时间下孢子在2龄幼虫表皮上萌发率和附着胞的产生数量明显多于4龄幼虫表皮。对接种24h和26h的2龄和4龄幼虫体表进行了扫描电镜的观察,发现2龄幼虫的表皮上24h时开始有孢子萌发出现,36h时孢子的萌发数增多,芽管也继续伸长;4龄幼虫表皮上基本上没有发现孢子的萌发现象。提取不同龄期斜纹夜蛾幼虫体表脂类成分,以该提取物处理CQNr01的孢子,然后在水琼脂培养基和SMAY培养基上培养,观察经不同龄期幼虫的表皮脂类处理后的孢子萌发情况,发现在贫营养的水琼脂培养基上,表皮中的脂类成分能够被菌株CQNr01的孢子生长萌发所利用,而在营养丰富的培养基上,脂类成分对菌株CQNr01孢子的萌发显示抑制作用,并且4龄表皮提取物抑制作用更为明显。结论:莱氏野村菌CQNr01菌丝生长和产孢的最佳温度为25℃,最适pH值为6.5。其对斜纹夜蛾幼虫高龄幼虫侵染能力的降低主要受昆虫体壁结构和表皮成分的影响。低龄幼虫表皮更有利于孢子侵染结构的产生和侵入,而高龄幼虫表皮不利于孢子的附着和侵染结构形成。当营养缺乏时,斜纹夜蛾幼虫表皮中的脂类成分能够被菌株CQNr01的孢子生长萌发所利用;而提供生长所需要的营养时,孢子选择培养基上更容易被利用的营养物质,脂类成分对孢子的萌发总体显示抑制作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 绪论
• 1.1 研究的目的和意义
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 莱氏野村菌
• 1.2.2 莱氏野村菌的分类
• 1.2.3 虫生真菌引起的昆虫病害流行
• 1.2.4 流行病的诱导
• 1.2.5 莱氏野村菌杀虫剂的田间应用
• 1.2.6 莱氏野村菌和化学农药的兼容性
• 1.2.7 莱氏野村菌侵染昆虫致病的病理过程
• 1.2.8 昆虫体壁对真菌侵入的屏障作用
• 1.3 研究内容和技术路线
• 1.3.1 研究内容
• 1.3.2 技术路线
• 1.4 创新之处
• 2 菌株培养与鉴定
• 2.1 供试材料
• 2.1.1 菌株来源
• 2.1.2 菌株分离纯化培养基
• 2.1.3 主要试剂及试剂盒
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 菌种的分离纯化与保存
• 2.2.2 菌株的生物学形态鉴定
• 2.2.3 菌株的分子鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 菌株CQNr01 的形态特征
• 2.3.2 菌株CQNr01 的分子鉴定
• 3 菌株 CQNr01 培养条件的优化
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 主要仪器设备
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 CQNr01 菌株生长及产孢测定
• 3.2.2 菌株CQNr01 基础培养基的筛选
• 3.2.3 菌株CQNr01 培养特性研究及培养条件优化
• 3.2.4 莱氏野村菌CQNr01 表皮降解酶测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 不同基础培养基对菌株CQNr01 菌丝生长及产孢的影响
• 3.3.2 培养温度对菌株CQNr01 生长及产孢的影响
• 3.3.3 培养基酸碱度对菌株CQNr01 生长及产孢的影响
• 3.3.4 莱氏野村菌CQNr01 表皮降解酶的产生能力
• 4 菌株 CQNr01 对斜纹夜蛾的致病力测试
• 4.1 供试材料
• 4.1.1 供试虫源与菌株
• 4.1.2 主要仪器和设备
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 孢子悬液的制备
• 4.2.2 孢子液浸泡法对斜纹夜蛾不同虫态的致病力测定
• 4.2.3 孢子液注射法对斜纹夜蛾不同虫态的致病力测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 斜纹夜蛾不同龄期幼虫菌悬液浸泡接种死亡率结果
• 4.3.2 斜纹夜蛾不同龄期幼虫注射孢子悬浮液后死亡率
• 5 斜纹夜蛾表皮对 CQNr01 菌株孢子萌发的影响
• 5.1 供试材料
• 5.1.1 供试虫源与菌株
• 5.1.2 主要仪器和设备
• 5.1.3 主要试剂
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 孢子悬液的制备
• 5.2.2 离体表皮上孢子的荧光显微镜观察
• 5.2.3 扫描电子显微镜样品的制备与观察
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 离体表皮上孢子的萌发及附着胞产生
• 5.3.2 菌株CQNr01 在斜纹夜蛾幼虫表皮上的附着及萌发
• 6 斜纹夜蛾表皮脂类成分的对 CQNr01 孢子萌发的影响
• 6.1 供试材料
• 6.1.1 供试虫源与菌株
• 6.1.2 主要仪器与设备
• 6.1.3 主要试剂
• 6.2 试验方法
• 6.2.1 斜纹夜蛾幼虫表皮脂类的提取
• 6.2.2 脂类提取物对孢子萌发的影响观察
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 斜纹夜蛾幼虫表皮中的脂类的含量
• 6.3.2 斜纹夜蛾幼虫表皮脂类提取物对孢子萌发的影响
• 7 讨论
• 7.1 莱氏野村菌CQNr01 菌株的最适培养条件
• 7.2 莱氏野村菌CQNr01 菌株的蛋白酶有几丁酶活性
• 7.3 不同侵染方法对斜纹夜蛾不同龄期幼虫的致病力差异
• 7.4 斜纹夜蛾幼虫表皮对菌株CQNr01 孢子的影响
• 8 结论与展望
• 8.1 主要结论
• 8.1.1 菌株CQNr01 的分离鉴定
• 8.1.2 菌株CQNr01 的最适生长条件
• 8.1.3 不同侵染方法对斜纹夜蛾不同龄期幼虫的致病力差异
• 8.1.4 菌株在斜纹夜蛾不同龄期幼虫表皮上的侵染结构形成的差异
• 8.1.5 斜纹夜蛾幼虫表皮脂类对菌株CQNr01 孢子的萌发影响
• 8.2 后续研究工作的展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• A 作者在攻读硕士学位期间所发表的文章