外用细菌纤维素对兔耳创面愈合影响的实验研究

论文摘要

背景纤维素是广泛分布于地球的生物聚合物,植物（如树木、苎麻、棉花等）中其含量十分丰富,是细胞壁的主要成分,也是诸多真菌、藻类的主要成分。但近年发现一些细菌也能产生纤维素,其结构、理化特性和生化特性等皆与植物纤维素有较大的差异。根据国外学者文献报道：细菌也能产生纤维素,这最早是由Brown于19世纪80年代末首次报道的。与植物纤维相比,细菌纤维素是目前最细的天然纤维,属纳米级纤维,大小仅为人工合成纤维的1/10,它已作为一种新兴的生物材料受到科学界的广泛关注。因为这种纤维素是由细菌产生,所以这种纤维素被称为细菌纤维素（Bacterial Cellulose,简称BC）,又被称为微生物纤维素（microbial cellulose）。人们发现BC已经将近120年,但是真正开始研究不过是近来不到20年的事情。目前主要集中在木醋杆菌（英文名：Acetobacter xylinum革兰氏阴性杆菌属）的研究,因其产量最高,研究最多。天然纤维素有Ⅰ,Ⅱ两种分型,根据X-射线分析,木醋杆菌所产生的纤维素属于Ⅰ型。木醋杆菌纤维素的产生过程大致是：细胞壁上约有50～80个孔,由里往外分泌纤维素,先由直链多糖聚合成胶状聚合物,然后再由上述聚合物形成走向与菌体长轴平行的纤维束。世界各国的广泛重视生物医学材料,目前对细菌纤维素的研究主要集中在附加值较高的医学生物材料上,例如组织工程支架、骨支架、软骨支架、人工血管、人工皮肤以及药物载体等方面。在我国,人们对细菌纤维素的了解和认识还不足,对其研究尚处于初级阶段,大部分集中在食品、食品添加剂和造纸应用等方面,在生物医用材料上的开发应用上相关报道较少。细菌纤维素由于具有独特的生物亲和性、生物相容性、生物可降解性、生物适应性和无过敏反应,以及高的持水性和结晶度、良好的纳米纤维网络、高的张力和强度,尤其是良好的机械韧性。因此在组织工程支架、人工血管、人工皮肤以及治疗皮肤损伤等方面具有广泛的用途,是国际生物医用材料研究的热点之一。细菌纤维素生产工艺简单,不含毒性物质,费用低。具有良好的生物适应性,很好的韧性强度和水合度,有利于皮肤组织生长和限制感染。这些都是作为烧伤患者和慢性皮肤溃烂患者的生物敷料及临时皮肤的有利条件。目的细菌纤维素（Bacterial Cellulose, BC）具有独特的生物亲和性、相容性和高度的持水性。通过建立兔耳创面愈合模型,外用BC于兔耳创面,观察BC能否促进成纤维细胞的移动和增生,抑制其分化,从而影响胶原沉积。通过随机、平行、对照观察进一步了解其对创面愈合的影响。方法取4月龄新西兰白兔18只,雌雄不限,体重2.0～2.5kg。戊巴比妥于耳缘静脉缓慢推注麻醉后（1.0 ml/kg）,兔耳背、腹侧面皮肤碘伏、酒精消毒,用弹簧分规于游标卡尺量取半径0.5 cm,于兔耳腹侧皮肤表面刻画出6个直径为1 cm的圆,内外侧各3个,间隔1.5 cm,切除圆内皮肤,保留软骨膜及软骨。根据所用敷料不同,随机将216个创面分为6组,每组36个创面。分别用纱布、BC（1：5）、BC（1：6）、BC（1：8）、纳米银、油纱敷料覆盖创面,作为A、B、C、D、E、F组。术后3、7、10、14、18、28 d取创面标本行组织学及免疫组织化学染色观察成纤维细胞、炎性细胞等,并检测标本中羟脯氨酸（hydroxyproline, Hpr）含量；取材时间点为28 d的36个兔耳创面,术后观察实验动物一般情况；于术后0、2、4、6、8、10 d大体观察创面愈合情况,记录愈合时间及残余创面比率。结果1.一般情况术后对兔耳的包扎固定良好,未引起兔耳坏死,实验动物全部存活至实验取材完成,满足实验要求。2.观察大体形态学及平均愈合时间实验组（B、C、D）术后4 d可以看到明显的肉芽组织生长,呈玻璃样透明的细颗粒状,鲜红透亮,柔软湿润,触之易出血,生长速度很快,第3-7 d虽然没有见到明显的创面收缩,但有新生的毛细血管长入,肉芽组织已经生长丰富,在8-12 d创面迅速缩小,甚至愈合,效果非常明显,且未见感染,创区干净,抑菌效果非常好,且愈合后创面平整,基本看不到瘢痕。创面A肉芽组织生长较慢,淡红色,创面分泌物少,大约从第5 d开始创面逐渐缩小,先收缩创面,然后不断生成肉芽组织,偶有细菌感染。创面E呈现绿色（敷料染色皮肤组织）,比较干燥,渗液少,无感染迹象,抑菌效果较好。创面F愈合有延迟现象,长期贴敷不更换,容易出现感染,愈合速度比各组稍慢。A-F组创面愈合时间分别为A组（13.0±1.5）、B组（12.0±0.9）、C组（13.3±1.0）、D组（10.2±0.8）、E组（16.5±1.0）、F组（18.7±2.6）d,各组间愈合时间有显著性差异（P<0.001）,创面愈合时间B、C、D组较E、F组短,D组较A组短。3.观察残余创面比率根据Matlab图形处理软件,编制计算创面愈合率的二值化灰度图程序,根据被测物所对应的像素数以及每个像素的实际面积,利用图像技术分别测量参考物和被测伤口像素数,得出像素比,即面积比率,即得出残余创面愈合率。方差分析表明各组间有显著性差异（F=18.201,P=0.000）,用LSD法进行组间两两比较,结果显示D组和其它各组间差异性均显著（P<0.01）；其它各组间比较,差异不明显,统计学分析结果显示无统计学意义（P>0.05）,D组较其它各组疗效好。4.观察创面愈合组织学变化4.1光镜观察组织HE染色术后第7d,A、E、F组可见：巨噬细胞（创面愈合的“调控细胞”）主要出现在周围正常组织,于创面愈合部位出现较晚；到第10 d可见数量较多染色较深的成纤维细胞,毛细血管增生活跃；于第14-18 d可见大量的成纤维细胞,血管数量较多,管壁增厚,内皮细胞增生；28 d时仍可见大量成纤维细胞和毛细血管,管壁继续增厚,内皮细胞继续增生。术后从第3 d开始,B、C、D组可见：毛细血管长入炎性细胞浸润的肉芽组织,纤维母细胞散在分布于毛细血管网络之间；于第7 d,上皮样郎格汉斯细胞以阿米巴样运动游走于周围正常组织和创面内部,吞噬炎症介质,伤口软骨细胞无坏死；3-18 d实验组肉芽组织较对照组生长丰富且干净,且无焦痂形成,上皮化过程较对照组早且明显；28 d时有部分血管数量减少,甚至闭塞。A组的炎性细胞的数量及毛细血管的数量少于实验（B、D）组,跟C组差不多,术后第10 d可见数量较多的染色较深的成纤维细胞,毛细血管增生活跃。A组的炎性细胞及毛细血管的数量较E、F组稍多。4.2光镜观察组织Masson染色术后第7～10 d, B、C、D组创面修复区域的胶原纤维较细小,排列较整齐；而A、E、F组胶原纤维相对较粗大,A组胶原纤维是粗细混合,排列稍紊乱,E、F组多数情况下创区粗胶原纤维较多。6组术后第14 d胶原染色增强,至第18～28 d,均表现为粗大的排列紊乱的胶原纤维,镜下观察并无明显区别。4.3光镜观察组织免疫组化（S-P法）术后第7 d,兔耳的腹、背部正常组织大、中、小血管处都有a-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的特异性褐色表达,兔耳各组正常组织阳性表达基本差不多。但在创面愈合部位存在较大区别,由于B、C、D组肉芽组织和新生血管生长丰富,故阳性表达强度为：D组>B组>C组>A组>E组>F组。术后7 d,E、F组肉芽组织生成少,新生血管明显要比实验组少。第3-18 d,褐色阳性表达逐渐加深,于血管丰富处最明显。5.氯胺T法测定组织的Hpr含量应用改进的氯胺T法测定组织中的Hpr含量,对数据行方差分析后结果显示：术后3-28 d,C组与F组,D组与其它各组比较,差异有统计学意义：P≤0.05；LSD检验：于创伤愈合期（3～18 d）,D组Hpr含量高于A、B、C、E、F组,即D组可以促使创面在愈合早期产生最多的胶原纤维。结论1)本实验兔耳腹面的全层皮肤缺损后,可以产生与人组织学结构类似的创面愈合过程,并且可以产生与人类相似的增生性瘢痕,进一步验证了兔耳创面愈合实验动物模型的科学性。2)采用国际公认的MATLAB图形处理软件计算残余创面率,提高了创面愈合面积计算的准确性。此方法是一种值得推广的创面愈合面积计算方法。3)外用细菌纤维素能缩短兔耳创面愈合时间,效果比较明显。4)促进兔耳创面愈合过程中,细菌纤维素敷料优于医用油纱、医用纳米银敷料。5)吸水性比例为1：8的细菌纤维素为促进兔耳创面愈合的最适敷料,效果最明显。6)细菌纤维素有望成为一种新型的创面愈合相互型医用敷料。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 外用细菌纤维素对兔耳创面愈合影响的实验研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第二部分 外用细菌纤维素影响兔耳创面愈合的形态学及组织学观察
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 综述
• 参考文献
• 中英文缩略词对照表
• 攻读学位期间成果
• 致谢
• 统计学合格证明