骨髓基质细胞诱导神经干细胞分化的蛋白质的微阵列分析

论文摘要

目的:神经干细胞（Neural Stem Cells,NSCs）是具有分化为神经元细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力,可自我更新并提供脑组织细胞的干细胞。Reynods和Richards等于1992年首次从成年动物脑中培养出了具有NSCs特性的细胞,之后科学家发现成人的中枢和外周神经系统中都有NSCs的存在,NSCs的出现为神经退行性疾病如帕金森病、阿尔茨海默病的功能重建以及神经系统损伤如脑、脊髓损伤的修复带来了希望。但无论是体外还是体内研究的结果,NSCs分化为神经元的比例都明显低于胶质细胞,致使难以达到理想的替代因损伤和疾病等原因造成的神经元缺失的目的。骨髓基质细胞（Bone Marrow Stromal Cells,BMSCs）是来源于骨髓的多潜能干细胞,体外培养具有粘附特性及克隆样增殖特征,其主要功能是支持和营养造血细胞。近年来研究发现BMSCs能分泌许多具有神经保护和修复作用的细胞因子,如脑源性神经营养因子（BDNF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、白细胞介素（IL）、转化生长因子（TNF）等,而且这些细胞因子对NSCs的存活、增殖以及分化也有一定影响。我们已证实BMSCs能够诱导中脑NSCs分化为高比例神经元,并且是BMSCs分泌至培养液中的可溶性分子（如细胞因子等）在这一过程中发挥了重要作用,但究竟是什么可溶性分子在起作用目前尚不清楚。本研究旨在通过用Neurobasal作为BMSCs的条件培养液（即Neurobasal Conditioned Medium,N-CM）,将其分段之后分别培养NSCs,初步筛选出对NSCs分化具有调节作用的BMSCs条件培养液,再经过含有19种大鼠细胞因子抗体的蛋白质微阵列检测,确定了其中所含的部分细胞因子,初步探讨了BMSCs调节NSCs分化的机制。方法:常规方法提取SD青年期大鼠BMSCs以及新生大鼠的中脑NSCs。将3-6代的BMSCs接种于25ml培养瓶中,待细胞铺满瓶底面积的约85%后,弃培养液,更换为Neurobasal培养液6 ml,培养24 h后收集上清,离心后上清液即为N-CM,-800C保存备用,共收集300ml。将N-CM解冻混匀后,经超滤浓缩分为大于5KDa（N-CM>5KDa）和小于5KDa （N-CM <5KDa）组两部分,用这两部分培养液分别培养NSCs,实验共分为4组:（1） Neurobasal组:用Neurobasal培养液培养NSCs。（2） N-CM组:用N-CM培养NSCs。（3）N-CM>5KDa组:用分子量大于5KDa的N-CM培养NSCs。（4）N-CM<5KDa组:用分子量小于5KDa的N-CM培养NSCs。于分化第3天进行细胞免疫化学染色并在荧光显微镜下观察细胞生长状态,并且通过细胞计数确定其中能调节NSCs分化的部分进行大鼠细胞因子抗体芯片检测。结果采用SPSS13.0统计软件处理,所有计量资料采用均数±标准差表示,各组之间采用t检验进行显著性分析。结果:1.不同培养基对NSCs分化的影响:（1） Neurobasal组:细胞总体生长状况很差,细胞核多有固缩、破碎,MAP-2阳性的神经元稀少,而且突起不明显,神经元大多聚集在干细胞球的周围。NG2阳性的少突胶质细胞突起长度较短。GFAP阳性的星形胶质细胞数量较多。（2） N-CM组:细胞生长状况较好,胞核比较均一,很少有破碎,MAP-2阳性的神经元较Neurobasal组多,且着色深,突起明显。NG2阳性的少突胶质细胞突起较长,荧光着色较亮。GFAP阳性的星形胶质细胞数量有所减少。（3）N-CM>5KDa组:细胞生长状况良好,细胞核大小均一、饱满,MAP-2阳性的神经元占多数,着色明显,突起较长,神经元大多可以迁移到离干细胞球较远的距离。NG2阳性的少突胶质细胞突起较长,荧光着色更亮。GFAP阳性的星形胶质细胞数量较少。（4）N-CM<5KDa组:细胞生长状况极差,第3天染色时大部分细胞已死亡,未进行细胞染色。2.各组细胞计数以及统计学结果:（1）分化为MAP-2阳性神经元的计数:N-CM组NSCs分化为神经元的比例（22.16±9.11%）高于Neurobasal组（17.00±7.69%）,结果有统计学差异（p=0.021,p<0.05）,说明N-CM可以诱导NSCs向神经元方向分化,而N-CM>5KDa组（34.24±15.94%）高于N-CM组（p=0.0006,p<0.01）,说明N-CM大于5KDa的部分在这一过程中起主要作用。（2）分化为NG2阳性的少突胶质细胞的计数:N-CM组NSCs分化为少突胶质细胞的比例（25.82±7.79%）高于Neurobasal组（21.32±9.09%）,结果有统计学差异（p=0.044,p<0.05）,而N-CM>5KDa组（41.01±8.88%）高于N-CM组（p=0.000,p<0.01）,结果有显著性差异,说明N-CM可以诱导NSCs向少突胶质细胞方向,并且N-CM大于5KDa的部分在这一过程中发挥主要作用。（3）分化为GFAP阳性的星形胶质细胞的计数:N-CM>5KDa组NSCs分化为星形胶质细胞的比例（23.10±13.57%）低于于Neurobasal组（37.99±10.75% p=0.000,p<0.01）和N-CM组（35.07±8.96% p=0.001,p<0.01）,结果均有统计学差异,但Neurobasal组和N-CM组的星形胶质细胞的比例没有统计学差异（p=0.611,p>0.05）,说明N-CM>5KDa对NSCs的分化为星形胶质细胞有抑制作用。3.蛋白质微阵列分析使用含有19种细胞因子抗体的蛋白质微阵列检测N-CM大于5KDa组和对照组（Neurobasal>5KDa组）,其结果表明,与对照组相比,N-CM>5KDa组有7种细胞因子表达上调了1.5倍,分别为中性粒细胞趋化因子-3、睫状神经营养因子、干扰素-γ、白细胞介素-1α、单核细胞的趋化蛋白-1、金属蛋白酶组织抑制剂-1和血管内皮生长因子。没有表达下调的细胞因子。结论:本研究以Neurobasal作为BMSCs的条件培养液,初步探讨了BMSCs调节NSCs分化的细胞因子机制。研究证实:1、BMSCs分泌的可溶性分子对NSCs分化为神经元和少突胶质细胞有促进作用并促进其成熟,还对NSCs分化为星形胶质细胞有抑制作用,其中分子量大于5KDa的细胞因子起关键作用。2、BMSCs分泌的可溶性分子中CINC-3、CNTF、IFN-γ等7种细胞因子可能在这一调节作用中发挥效应。3、BMSCs分泌的可溶性分子可以促进NSCs分化的为神经元迁移较远的距离。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 参考文献
• 综述 骨髓基质细胞的分泌蛋白及其功能
• 致谢
• 个人简历