论文摘要
研究背景及目的胃癌是消化道常见恶性肿瘤,根据WHO统计其致死率在各种恶性肿瘤中居第二位。为了更好的预防、诊断和治疗该类疾病,就必须明确其发病的机制。目前人们已经提出了萎缩性胃炎→肠化生→不典型增生→胃癌的演变过程,并且知道在此过程中肠化生是演变成为胃腺癌的重要阶段。此过程使所在部位粘膜上皮细胞分化紊乱,所以揭示黏膜上皮细胞分化失去稳态或者说产生紊乱的机制对于理解从正常粘膜演变到癌前病变至肿瘤的过程非常重要,同时也为肿瘤的早期诊断、预防或有关病变的逆转治疗提供思路和理论依据。科学家们提出幽门螺杆菌感染可以引发慢性活动性胃炎然后导致在胃窦和胃体部出现肠上皮化生,这种病变最终可能发展成为高分化的胃腺癌。并认定幽门螺杆菌是导致胃癌发生的一类致癌因子。近几年有研究显示幽门螺杆菌毒性因子CagA可以诱导胃粘膜上皮细胞出现肠上皮表型标志物,因此关于幽门螺杆菌如何导致胃粘膜出现肠化的现象称为该领域的研究热点。但是其如何导致胃粘膜细胞出现肠上皮表型的具体分子机制并不清楚。核转录因子SOX2是决定胃粘膜上皮分化的一个重要转录因子,控制胃粘膜上皮细胞的分化。核转录因子Hath1是调节肠粘膜隐窝干细胞分化为肠粘膜细胞的关键调控因子,能够控制杯状细胞的发育。近期已有研究提示在胃炎、肠化生至胃癌的变化过程中SOX2的表达逐渐减少。而SOX2/Hath1异常表达与胃癌的临床病理特点未有报道,其是否为胃癌病人生存的预后因素亦未有研究。Hp在胃上皮细胞的感染可以通过IL-4/STAT6信号通路抑制SOX2表达已被证实,但是Hath1在胃上皮细胞的异常表达机制及其与幽门螺杆菌感染的关系目前仍然不清楚。研究方法1、核转录因子Hath1和SOX2在胃组织的表达及其与临床病理和预后关系的研究（1）收集临床病例标本,制作石蜡切片,应用免疫组化学的方法检测SOX2/Hath1在胃的正常组织、肠化组织及胃癌中的表达情况。（2）对病理标本进行相关的组织学染色如:HE染色、HID/AB染色、AB/PAS染色、Gimsa染色、银染色,通过这些染色方法确定相应病例的组织学分型、幽门螺杆菌感染情况。（3）查阅临床病例资料了解患者的性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、胃癌浸润程度、淋巴结转移范围,术后生存时间等临床资料。（4）统计分析总结出SOX2/Hath1转录因子在不同胃组织病变中的表达差异及其与患者临床特点和预后的的关系。2、幽门螺杆菌对胃上皮细胞SOX2/Hath1表达的影响及影响机制研究。各种不同分化程度的胃癌细胞株中的SOX2/Hath1蛋白的表达水平,Hp对这两种因子的影响及其机制研究。（1）应用WB检测各种细胞株中Hath1和SOX2的表达水平,选取相应的细胞株与幽门螺杆菌国际标准菌株26695（CagA阳性）及其突变体（CagA阴性）、培养上清和菌体裂解液与细胞共培养,选取0h、3h、6h、12h和24h时间点,检测不同因素作用下SOX2/Hath1蛋白表达情况。（2）根据已有文献报道,选取Hp感染胃粘膜后致慢性炎症的炎性因子IL-8,IL-6、IL-1β,分别采用时间效应（0h、1h、3h、6h）和浓度效应（0ng、25ng、50ng、100ng）的方法,刺激胃癌细胞株后,运用WB方法检测刺激后Hath1蛋白的表达水平有无变化。（3）细胞因子致Hath1蛋白表达增高的机制研究。分别检测Hp和IL-8作用下胃细胞系中Hes1的表达情况。用蛋白酶抑制剂MG132和Hp与胃细胞株共培养后检测Hes1蛋白水平。运用WB检测IL-8和IL-6刺激后胃细胞株中P-STAT3和STAT3的表达,再用酪氨酸激酶抑制剂AG490和IL-8共刺激细胞,观察对P-STAT3、STAT3、Hath1和Hes1表达的影响。结果1、经免疫组化染色胃正常、肠化组织至胃癌病变中Hath1有表达增高的趋势,而SOX2表达明显降低。SOX2高表达病人较SOX2低表达病人有更好的预后;2、Hp（CagA阳性或阴性）与MKN28细胞共培养可使Hath1蛋白表达增高,并且随作用时间延长Hath1表达量逐渐递增。Hp（CagA阳性或阴性）与MKN45细胞共培养可使SOX2蛋白表达逐渐减少。3 Hp 26695活菌与MKN28细胞共孵育致细胞内Hes1的表达明显减少。4、随着作用浓度增高和作用时间的延长,细胞因子IL-8能够促使MKN28细胞的Hath1蛋白表达增高。IL-6和IL-1β对MKN28细胞的Hath1蛋白表达无影响。5、IL-8刺激MKN28细胞后,磷酸化STAT3的表达水平明显增高但是非磷酸化的STAT3无变化,而在IL-6作用下磷酸化的STAT3和非磷酸化的STAT3表达均增加。6、用AG490抑制MKN28细胞的磷酸化,非磷酸化的STAT3明显增加,而磷酸化的STAT3没有改变。尽管IL-8的刺激存在,但是Hath1的表达被抑制,没有明显改变。Hes1的表达在MKN28细胞内没有受到IL-8和磷酸化抑制的影响。结论1、在胃癌组织中,Hath1蛋白的表达增高,SOX2和Hath1呈现出相反的表达趋势。SOX2对胃癌病人的预后有利并且与肿瘤的转移和临床分期相关。2、Hp感染胃上皮细胞时,Hes1蛋白的表达受到抑制,Hath1蛋白因为Hes1的抑制而表达增高,这种机制也许与Hp的直接作用有关。3、Hp感染胃上皮细胞时,炎性因子之一的IL-8刺激了STAT3的磷酸化从而上调了Hath1蛋白的表达;Hath1上调表达的机制与CagA存在与否无关。
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