新型KATP开放剂埃他卡林对原代培养人肺动脉平滑肌细胞TGF-β1、PCNA mRNA表达的影响

论文摘要

肺动脉高压（Pulmonary artery hypertension,PAH）是慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease,COPD）发展为慢性肺源性心脏病（Chronic cor pulmonale）的关键环节。目前对PAH的发病机制尚未完全阐明,国内外对该病尚缺乏有效的治疗手段。因此,对PAH形成机制的研究及其研发有效的防治药物显得尤为必要。PAH患者肺血管阻力（Pulmonary vascular resistance,PVR）和肺动脉压（Pulmonary arterial pressure,PAP）持续增高的主要原因是肺动脉收缩和肺血管重构,而肺血管重构最大的特征是肺动脉平滑肌细胞（Pulmonary artery smooth muscle cells）增殖增加和（或）凋亡减少所致的肺动脉中层增厚。近年来,肺血管平滑肌细胞钾通道在肺动脉重构中的作用日益引起人们的关注。钾通道功能下降,细胞内K+外流减少,细胞膜去极化,继而引起细胞浆内游离Ca2+浓度(Cytoplasmic free Ca2+concentration,[Ca2+]Cyt)增加,刺激肺动脉平滑肌细胞增殖,进一步加重血管管壁重构;另一方面,肺动脉平滑肌细胞钾通道功能下降,细胞内K+增多,凋亡性容积减少（Apoptoticvolume decrease,AVD）作用减弱,胞浆胱门蛋白酶活性下降,细胞凋亡则减少,亦加重肺血管重构。目前,肺血管平滑肌细胞钾通道主要分为以下四类:（1）电压依赖性钾（Kv）通道,（2）Ca2+激活性钾(KCa)通道,（3）二孔钾(K2P)通道,（4）内向整流性钾(KIR)通道。其中ATP敏感性钾(KATP)通道是一类内向整流性钾通道,其活性受胞内ADP/ATP调控,因此,KATP通道将细胞代谢和膜电位相偶联,已经成为研发新型治疗PAH药物的重要靶标。埃他卡林（Iptakalim,IPT）是我国自行设计、合成的新型选择性KATP开放剂。本课题组前期研究发现,IPT不仅降低大鼠缺氧性肺动脉高压,逆转大鼠缺氧性肺动脉重构和右心室肥厚;还抑制内皮素-1（Endothelin-1,ET-1）诱导的兔、人肺动脉平滑肌细胞[Ca2+]Cyt增加和细胞增殖。近年研究发现,转化生长因子β1（Transforming growth factorbeta-1,TGF-β1）和增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen,PCNA）是肺动脉重构的重要细胞因子。并且本课题研究亦发现,IPT能抑制大鼠缺氧性肺动脉高压时肺动脉平滑肌细胞TGF-β1和PCNA表达。然而在原代培养人肺动脉平滑肌细胞中,IPT对TGF-β1、PCNA表达是否有作用,尚需进一步研究。ET-1是导致肺动脉高压时肺动脉平滑肌细胞增殖、肺动脉重构的重要活性物质。本文分别以ET-1和缺氧诱导细胞,研究IPT对人肺动脉平滑肌细胞TGF-β1和PCNA表达的影响,以进一步探讨KATP通道调控肺动脉重构的作用机制。第一部分:新型KATP开放剂埃他卡林对ET-1诱导原代培养人肺动脉平滑肌细胞TGF-β1、PCNA mRNA表达的影响目的观察新型KATP开放剂埃他卡林（IPT）对ET-1诱导原代培养人肺动脉平滑肌细胞TGF-β1和PCNA mRNA表达的影响。方法分离3～4级人肺小动脉,按照组织贴块法原代培养人肺动脉平滑肌细胞,应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RQ-RT-PCR）技术检测TGF-β1和PCNA mRNA表达变化。结果ET-1(10-5mol·L-1)诱导人肺动脉平滑肌细胞TGF-β1、PCNA mRNA表达均增加;在相同条件下,加入ET-1(10-5mol·L-1)的同时,分别在培养液中加入IPT10-7、10-6、10-5mol·L-1,TGF-β1和PCNA mRNA表达分别呈浓度依赖性地下降;加入ET-1(10-5mol·L-1)、IPT(10-5mol·L-1)前30min,预先加入特异性KATP拮抗剂格列本脲（GLI）10-7、10-6、10-5mol·L-1,GLI呈浓度依赖性地拮抗IPT的抑制作用。结论IPT通过激活KATP通道,浓度依赖性地抑制ET-1诱导原代培养人肺动脉平滑肌细胞TGF-β1、PCNA mRNA表达。第二部分:新型KATP开放剂埃他卡林对缺氧诱导原代培养人肺动脉平滑肌细胞TGF-β1和PCNA mRNA表达的影响目的观察新型KATP开放剂埃他卡林（IPT）对缺氧诱导原代培养人肺动脉平滑肌细胞TGF-β1和PCNA mRNA表达的影响。方法分离3～4级人肺小动脉,按照组织贴块法原代培养人肺动脉平滑肌细胞,应用RQ-RT-PCR技术检测细胞TGF-β1和PCNA mRNA表达变化。结果缺氧使人肺动脉平滑肌细胞TGF-β1和PCNA mRNA表达增加;相同条件下,在缺氧的同时,分别在培养液中加入IPT 10-7、10-6、10-5mol·L-1,TGF-β1和PCNA mRNA表达均呈浓度依赖性地下降;加入IPT(10-5mol·L-1)前30 min,预先加入格列本脲（GLI）10-5mol·L-1,IPT的抑制作用消失。结论IPT通过激活细胞KATP通道,浓度依赖性地抑制缺氧诱导原代培养人肺动脉平滑肌细胞TGF-β1和PCNA mRNA表达增加。

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• ATP开放剂埃他卡林对ET-1诱导原代培养人肺动脉平滑肌细胞TGF-β₁、PCNA mRNA表达的影响'>第一部分 新型K_ATP开放剂埃他卡林对ET-1诱导原代培养人肺动脉平滑肌细胞TGF-β₁、PCNA mRNA表达的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• ATP开放剂埃他卡林对缺氧诱导原代培养人肺动脉平滑肌细胞TGF-β₁、PCNA mRNA表达的影响'>第二部分 新型K_ATP开放剂埃他卡林对缺氧诱导原代培养人肺动脉平滑肌细胞TGF-β₁、PCNA mRNA表达的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 小结
• 致谢
• 附录
• 附录1（论文）
• 附录2（综述）
• 参考文献