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柿子单宁与牛血清白蛋白和磷脂酶A2相互作用的研究

2020-12-11阅读(153)

柿子单宁与牛血清白蛋白和磷脂酶A2相互作用的研究

论文摘要

白蛋白是血浆中含量最丰富的一种载体蛋白,可以与许多内源及外源化合物结合。进入生物体内的药物要通过血浆的的贮存和转运到达受体部位发挥药效,所以研究药物小分子和蛋白质的相互作用具有重要意义。众所周知,蛇毒毒液组成十分复杂,含有多种毒素、酶、蛋白质、肽等,而其众多的病理作用如神经毒性、肌肉毒性、出血毒性及致死作用等都与其所含蛋白酶的作用密切相关。在众多的酶中,磷脂酶A2（PLA2）分布广泛,在蛇毒的毒性中扮演着极其重要的作用,能导致如突触前神经毒性、心脏毒性、肌毒性、抗血小板聚集、溶血活性、水肿和惊厥等多种毒性。本实验室通过前期的研究发现,柿子单宁具有显著的解蛇毒功效。本论文基于揭示柿子单宁解蛇毒的可能作用机制,在前人工作的基础上,研究了不同条件下柿子单宁与BSA、PLA2的结合反应,并结合荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、傅立叶变换红外光谱、圆二色谱和SDS-PAGE凝胶电泳等技术手段探讨了柿子单宁与BSA、PLA2的相互作用机理。主要研究结果如下：1.PT40对BSA的结合能力明显HMWT,当BSA与PT40质量比达到5.75：1时,单宁沉淀率达到最大。PT40与BSA结合的最佳条件为：温度30℃,体系pH4.0,时间对结合反应无显著影响。荧光实验结果显示,在生理条件下,PT40对牛血清白蛋白的荧光猝灭过程属于静态猝灭。PT40浓度为0～2.06gM和2.06μM～4.051μM时,Stern-Volmer方程具有两段很好的线性,这两段直线相交于[PT40]≈2.06μM,并偏向Y轴；在PT40实验浓度范围内,Scacthard方程同样具有两段线性关系,说明PT40是通过两类结合部位与BSA结合,[PT40]<2.06μM,结合位点数为1.4；2.06μM<[PT40]<4.05μM时,结合位点数为2.0.红外和CD光谱分析分析说明PT40使BSA的二级结构发生了改变。热力学分析表明PT40和BSA之间主要以疏水作用力结合,而且是自发放热过程。共振散射分析说明BSA与PT40间未形成明显的聚集物。2.PT40对PLA2的结合能力比HMWT强。当PLA2与PT40质量比达到2.48：1时,单宁沉淀率达到最大。PT40与PLA2结合的最佳条件为：温度40℃,体系pH4.5-5.0,时间对反应无显著影响。荧光实验表明,在生理条件下,PT40对PLA2的荧光猝灭过程属于静态猝灭,而且紫外吸收光谱也进一步说明猝灭类型是静态猝灭。从实验结果看,当[PT40]<0.78μM时,PT40与PLA2的结合位点数约为1.2；当0.78μM<[PT40]<2.025μM时,其结合位点数约为1.9。随着PT40浓度的增加,静态猝灭和无辐射能量转移都是导致荧光猝灭的主要原因。热力学分析表明PT40和PLA2之间主要以疏水作用力结合,是一个自发放热过程。通过同步荧光光谱研究表明PT40与PLA2色氨酸残基和酪氨酸残基很接近,影响了色氨酸残基和酪氨酸残基的微环境。红外和CD光谱研究结果都表明PT40使PLA2的二级结构发生了变化。通过共振散射光谱分析得到PT40与PLA2作用的过程中虽然没有形成明显的沉淀而使得荧光光谱的强度有所变化,但是在二者间有聚集体的形成。3.采用蓝BSA标记法研究BSA、PLA2对PT40的竞争结合实验结果表明：当pH4.9时,BSA对PT40的结合能力比PLA2强,而pH7.4时,PLA2对PT40的结合能力比BSA强。同时SDS-PAGE结果也表明,在生理条件下（pH7.4）PLA2对PT40的结合能力强于BSA。通过测定竞争反应中PLA2酶活力变化发现,在生理pH条件下,PLA2能竞争性地夺取已与BSA结合了的PT40重新形成复合物,使反应体系中PLA2酶活性丧失,而当体系中PLA2与PT40反应形成稳定复合物后,竞争蛋白BSA不能破坏体系反应的平衡,不能阻止PLA2与PT40的结合。4.通过化学修饰剂对溴苯乙酸基溴（p-BPB）和乙酸酐对PLA2的His残基和Lys残基进行修饰后发现,PLA2酶活力明显下降,说明组氨酸残基和赖氨酸残基与PLA2酶活力有关。将PLA2组氨酸和赖氨酸进行经化学修饰后,其致死毒性明显下降,溶血活性和炎性反应均明显被抑制。与柿子单宁作用后,PLA2对小鼠的LD50（腹腔注射）由5.65mg/kg上升至11.06mg/kg,说明PT40对PLA2的致死毒性有明显的抑制作用。同时,与氨基酸残基修饰相似,PLA2与PT40作用后其溶血活性,诱导水肿反应也明显被抑制。SDS-PAGE凝胶电泳分析表明,His残基对PLA2与PT40结合反应影响较小,而Lys残基对PLA2与PT40结合反应影响很大,提示赖氨酸残基可能是PT40与PLA2的结合位点。SDS-PAGE凝胶电泳结合半干分子转印和NBT分析提示,PT40极有可能通过共价修饰PLA2分子中的赖氨酸残基,引起酶结构改变,进而降低其催化活性和毒性,这也许是PT40在复杂生物体内解蛇毒作用的机理之一。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 英文缩略语表
  • 第一章 前言
  • 1 单宁的研究现状
  • 2 单宁与蛋白质作用的研究现状及进展
  • 2.1 单宁与蛋白质作用的理论
  • 2.1.1 影响单宁-蛋白质结合的因素
  • 2.1.2 单宁-蛋白质反应的作用力
  • 2.1.3 单宁与蛋白质的结合理论
  • 2.2 单宁与蛋白质相互作用的研究进展
  • 2.2.1 荧光光谱法
  • 2.2.2 紫外-可见吸收光谱法
  • 2.2.3 红外光谱法
  • 2.2.4 共振光散射光谱
  • 2.2.5 圆二色谱法
  • 2.2.6 其他研究方法
  • 3 本论文研究内容及其意义
  • 第二章 柿子单宁与牛血清白蛋白相互作用的研究
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料和仪器设备
  • 1.1.1 实验材料
  • 1.1.2 主要试剂
  • 1.1.3 仪器设备
  • 1.2 试验方法
  • 1.2.1 柿子单宁与BSA的结合反应
  • 1.2.1.1 标准曲线绘制
  • 1.2.1.2 不同级分单宁（HMWT、PT40）与BSA结合能力的测定
  • 1.2.1.3 BSA浓度对结合反应的影响
  • 1.2.1.4 单宁浓度对结合反应的影响
  • 1.2.1.5 pH对单宁与BSA反应的影响
  • 1.2.1.6 时间对单宁与BSA反应的影响
  • 1.2.1.7 温度对单宁与BSA反应的影响
  • 1.2.2 PT40对BSA的荧光猝灭作用
  • 1.2.3 PT40与BSA作用的紫外吸收光谱分析
  • 1.2.4 相互作用对BSA构象的影响
  • 1.2.4.1 傅立叶变换衰减全反射红外差谱分析（FT-ATR-IR）
  • 1.2.4.2 圆二色谱分析（CD）
  • 1.2.5 PT40与BSA相互作用的共振散射光谱分析
  • 2 结果与分析
  • 2.1 BSA与不同级分单宁（HMWT、PT40）的结合反应
  • 2.1.1 BSA浓度对结合反应的影响
  • 2.1.2 单宁浓度对结合反应的影响
  • 2.1.3 pH值对单宁与BSA反应的影响
  • 2.1.4 时间对单宁与BSA反应的影响
  • 2.1.5 温度对单宁与BSA反应的影响
  • 2.2 PT40对BSA的荧光猝灭作用
  • 2.2.1 PT40对BSA荧光光谱的影响
  • 2.2.2 荧光猝灭机制
  • 2.2.3 PT40与BSA结合位点数
  • 2.2.4 PT40与BSA结合的热力学性质
  • 2.2.5 PT40与BSA作用距离的计算
  • 2.3 PT40与BSA作用的紫外吸收光谱分析
  • 2.4 相互作用对BSA构象的影响
  • 2.4.1 同步荧光法
  • 2.4.2 傅立叶变换衰减全反射红外差谱分析（FT-ATR-IR）
  • 2.4.3 CD分析
  • 2.5 PT40与BSA作用的共振光散射光谱
  • 3 结论
  • 2的相互作用的研究'>第三章 柿子单宁与蛇毒磷脂酶A2的相互作用的研究
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料和仪器设备
  • 1.1.1 实验材料
  • 1.1.2 主要试剂
  • 1.1.3 仪器设备
  • 1.2 试验方法
  • 2的结合反应'>1.2.1 柿子单宁与PLA2的结合反应
  • 2结合能力的测定'>1.2.1.1 不同级分单宁（HMWT、PT40）与PLA2结合能力的测定
  • 1.2.1.2 沉淀中各级分单宁含量的测定
  • 2的浓度对结合反应的影响'>1.2.1.3 PLA2的浓度对结合反应的影响
  • 1.2.1.4 单宁浓度对结合反应的影响
  • 2反应的影响'>1.2.1.5 时间对单宁与PLA2反应的影响
  • 2反应的影响 #4I'>1.2.1.6 温度对单宁与PLA2反应的影响 #4I
  • 2反应的影响'>1.2.1.7 pH值对单宁与PLA2反应的影响
  • 2活力的影响'>1.2.2 结合反应对PLA2活力的影响
  • 2活性的测定'>1.2.2.1 PLA2活性的测定
  • 2酶活力的影响'>1.2.2.2 不同量PT40对PLA2酶活力的影响
  • 2的荧光猝灭作用'>1.2.3 PT40对PLA2的荧光猝灭作用
  • 2作用的紫外吸收光谱分析'>1.2.4 PT40与PLA2作用的紫外吸收光谱分析
  • 2构象的影响'>1.2.5 相互作用对PLA2构象的影响
  • 1.2.5.1 傅立叶变换衰减全反射红外差谱分析（FT-ATR-IR）
  • 1.2.5.2 圆二色谱分析（CD）
  • 2相互作用的共振散射光谱分析'>1.2.6 PT40与PLA2相互作用的共振散射光谱分析
  • 2 结果与分析
  • 2的结合反应'>2.1 柿子单宁与PLA2的结合反应
  • 2浓度对结合反应的影响'>2.1.1 PLA2浓度对结合反应的影响
  • 2.1.2 单宁浓度对结合反应的影响
  • 2反应的影响'>2.1.3 时间对单宁与PLA2反应的影响
  • 2反应的影响'>2.1.4 温度对单宁与PLA2反应的影响
  • 2反应的影响'>2.1.5 pH值对单宁与PLA2反应的影响
  • 2活力的影响'>2.2 结合反应对PLA2活力的影响
  • 2的荧光猝灭作用'>2.3 PT40对PLA2的荧光猝灭作用
  • 2荧光光谱的影响'>2.3.1 PT40对PLA2荧光光谱的影响
  • 2荧光强度的影响'>2.3.2 作用时间对PT40-PLA2荧光强度的影响
  • 2.3.3 荧光猝灭机制
  • 2结合位点数的计算'>2.3.4 PT40与PLA2结合位点数的计算
  • 2结合的热力学性质'>2.3.5 PT40与PLA2结合的热力学性质
  • 2作用距离的计算'>2.3.6 PT40对PLA2作用距离的计算
  • 2作用的紫外吸收光谱分析'>2.4 PT40与PLA2作用的紫外吸收光谱分析
  • 2构象的影响'>2.5 相互作用对PLA2构象的影响
  • 2.5.1 同步荧光法
  • 2.5.2 傅立叶变换衰减全反射红外差谱分析（FT-ATR-IR）
  • 2.5.3 CD分析
  • 2作用的共振光散射光谱'>2.6 PT40与PLA2作用的共振光散射光谱
  • 3 结论
  • 2、BSA对柿子单宁竞争结合作用研究'>第四章 PLA2、BSA对柿子单宁竞争结合作用研究
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料与设备
  • 1.1.1 实验材料
  • 1.1.2 主要试剂
  • 1.1.3 仪器及设备
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 蓝BSA标记法
  • 1.2.1.1 蓝BSA的制备
  • 1.2.1.2 蓝BSA含量测定
  • 1.2.1.3 竞争反应
  • 1.2.2 SDS-PAGE分析
  • 2活力变化'>1.2.3 竞争反应中PLA2活力变化
  • 2活性的测定'>1.2.3.1 PLA2活性的测定
  • 2后上清液中PLA2活力的变化'>1.2.3.2 向BSA-PT40混合液中加入不同量竞争蛋白PLA2后上清液中PLA2活力的变化
  • 2-PT40混合液中加入不同量竞争蛋白BSA后上清液中PLA2活力的变化'>1.2.3.3 向PLA2-PT40混合液中加入不同量竞争蛋白BSA后上清液中PLA2活力的变化
  • 2 结果与分析
  • 2.1 蓝BSA标记法
  • 2.2 SDS-PAGE分析
  • 2活力变化'>2.3 竞争反应中PLA2活力变化
  • 3 结论
  • 2的化学修饰及对其结合单宁能力、活性及毒性的影响'>第五章 PLA2的化学修饰及对其结合单宁能力、活性及毒性的影响
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料和仪器设备
  • 1.1.1 实验材料
  • 1.1.2 主要试剂
  • 1.1.3 仪器设备
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 化学修饰
  • 1.2.1.1 组氨酸残基的化学修饰
  • 1.2.1.2 赖氨酸残基的化学修饰
  • 2修饰率的测定'>1.2.2 PLA2修饰率的测定
  • 2酶活力的影响'>1.2.3 化学修饰对PLA2酶活力的影响
  • 2对其单宁结合能力的影响'>1.2.4 化学修饰PLA2对其单宁结合能力的影响
  • 1.2.5 SDS-PAGE和半干分子印迹法分析
  • 1.2.5.1 SDS-PAGE分析
  • 1.2.5.2 半干分子印迹法分析
  • 2作用前后及氨基酸残基修饰对PLA2致死毒性的影响'>1.2.6 柿子单宁与PLA2作用前后及氨基酸残基修饰对PLA2致死毒性的影响
  • 2的急性毒性试验'>1.2.6.1 PLA2的急性毒性试验
  • 2致死毒性的影响'>1.2.6.2 赖氨酸残基化学修饰对PLA2致死毒性的影响
  • 2致死毒性的影响'>1.2.6.3 组氨酸残基化学修饰对PLA2致死毒性的影响
  • 2的急性毒性试验'>1.2.6.4 与柿子单宁作用后PLA2的急性毒性试验
  • 50值测定'>1.2.6.5 小鼠腹腔注射给药的LD50值测定
  • 1.2.7 溶血实验
  • 2诱导水肿反应'>1.2.8 PLA2诱导水肿反应
  • 1.2.9 统计学处理
  • 2 结果与分析
  • 2修饰率及酶活力的变化'>2.1 PLA2修饰率及酶活力的变化
  • 2对PT40结合能力的影响'>2.2 化学修饰PLA2对PT40结合能力的影响
  • 2.3 SDS-PAGE和半干分子印迹法分析
  • 2作用前后及氨基酸残基修饰对PLA2致死毒性的影响'>2.4 柿子单宁与PLA2作用前后及氨基酸残基修饰对PLA2致死毒性的影响
  • 2的急性毒性试验'>2.4.1 PLA2的急性毒性试验
  • 2致死毒性的影响'>2.4.2 化学修饰对PLA2致死毒性的影响
  • 2的急性毒性试验'>2.4.3 与柿子单宁作用后PLA2的急性毒性试验
  • 2.5 溶血活性
  • 2.6 炎性反应
  • 3 结论
  • 第六章 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读学位期间发表学术论文

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