腺病毒载体介导的脂联素基因RNAi对脂肪细胞的影响

论文摘要

第一部分腺病毒载体Ad-Acrp30-1抑制脂肪细胞分泌脂联素效果的鉴定目的本课题组构建的腺病毒载体Ad-Acrp30-1感染诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,检测Ad-Acrp30-1是否能有效抑制脂肪细胞脂联素的mRNA和蛋白的表达。方法IBMX+胰岛素+地塞米松诱导方案诱导分化小鼠3T3-L1前脂肪细胞,用重组腺病毒（MOI 100）感染脂肪细胞并设RNAi阴性对照,空白对照和未诱导对照,72h后用RT-PCR法检测脂联素mRNA的表达,ELISA法检测细胞上清中脂联素蛋白的表达。结果Ad-Acrp30-1腺病毒载体能显著抑制脂肪细胞中脂联素mRNA（0.66±0.04 vs 0.23±0.03, P<0.01）和蛋白（0.58±0.01 vs 0.23±0.01, P<0.01）表达,抑制率约为60%。结论构建的Acrp30基因特异性shRNA腺病毒载体能有效的抑制脂联素在3T3-L1脂肪细胞中的表达,为本实验进一步研究脂联素对脂肪细胞作用机制提供了有效平台。第二部分脂联素表达受抑制对脂肪细胞的影响目的利用所构建的腺病毒载体Ad-Acrp30-1抑制3T3-L1脂肪细胞Acrp30基因表达,探讨其对细胞基础代谢及胰岛素刺激后胰岛素敏感性、糖脂代谢及代谢相关基因,以及脂联素类似物CORS-26的影响。方法重组腺病毒感染诱导分化成熟的脂肪细胞并设RNAi阴性对照,空白对照和未诱导对照,利用糖转运和糖消耗实验测定细胞基础代谢下的糖转运的改变;利用RT-PCR和Dot blot检测基础代谢及胰岛素刺激下,脂肪细胞代谢及代谢相关基因的变化。结果脂肪细胞脂联素表达受抑制后,基础代谢葡萄糖消耗率和转运率明显下调（分别为P<0.01和P<0.05）,GLUT-1、GLUT-4 mRNA表达明显降低（分别为P<0.01和P<0.05）,且GLUT-4蛋白表达水平亦明显下降（P<0.01）;IRS-1、HSL mRNA表达明显降低（分别为P<0.05和P<0.01）,但ATGL、PPAR-α和PPARγmRNA未见明显差异。在胰岛素刺激下GLUT-1、GLUT-4 mRNA表达水平明显下降（分别为P<0.05和P<0.01）,而IRS-1、HSL、PPAR-αmRNA表达水平明显下降（分别为P<0.01、P<0.01和P<0.05）,ATGL和PPARγ未见明显差异,同时GLUT-4蛋白明显下调（P<0.01）,IRS-1酪氨酸磷酸化水平也明显下降（P<0.01）;胰岛素刺激下的GLUT-4、HSL和IRS-1下调程度较基础代谢状态更大（52% vs 35%, 60% vs 43%和48% vs 28%）,GLUT-4蛋白表达也有同样的结果（23% vs 16%）,但GLUT-1下降程度减小（40% vs 55%）。脂肪细胞因子visfatin mRNA水平下降,同时visfatin蛋白表达水平亦明显下调（P<0.01）。基础代谢状态下CORS-26 mRNA表达水平明显升高。结论脂联素表达缺陷可能通过抑制GLUT-1,GLUT-4,IRS-1和HSL的表达而影响葡萄糖转运和脂代谢,并可能影响着其它脂肪细胞因子如visfatin、CORS-26的表达。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分脂联素SIRNA 抑制脂肪细胞脂联素的表达
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分脂联素抑制对脂肪细胞脂糖脂代谢影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 图片
• 全文总结
• 参考文献
• 文献综述
• 致谢
• 研究生期间发表的文章