一种利用壳聚糖酶和甲壳素脱乙酰酶制备高脱乙酰度壳寡糖的方法

论文摘要

壳聚糖是目前在自然界中发现的唯一带正电荷的天然高分子化合物,是一种碱性多糖,为甲壳素脱乙酰的产物,难溶于水,其价格随脱乙酰度的增加而提高。壳聚糖的降解产物为壳寡糖,它有很多特殊的生理活性与功能,如抑制微生物的生长、抗肿瘤活性、调血脂。目前报道的功能性壳寡糖是指不同脱乙酰度寡糖的混合体,而专门针对高脱乙酰度壳寡糖的活性功能研究报道较少。获得高脱乙酰度壳寡糖的传统方法是利用强碱和高温长时间作用甲壳素以获得壳聚糖,再用壳聚糖酶水解这种高脱乙酰度的壳聚糖而制得。该方法能源消耗大、环境污染严重,因此,本文旨在利用毕赤酵母系统表达一种来自Aspergillus fumigatus的壳聚糖酶（CSN-P）和来自Colletotrichum lindemuthianum的甲壳素脱乙酰酶（CLCD）,从而将低脱乙酰壳聚糖转化为寡糖,并进一步脱去乙酰基团制备高脱乙酰度的壳寡糖,以建立一套节能、环保、高效、均相制备高脱乙酰度壳寡糖的方法,为其功能活性研究提供基础。本文利用overlapping PCR方法,按照毕赤酵母密码子偏爱性合成了Aspergillus fumigatus的壳聚糖酶基因并在毕赤酵母中实现了分泌表达。研究表明该壳聚糖酶在发酵罐中的蛋白表达量为3mg/ml,酶活力单位为25000U/ml。酶学性质研究表明CSN-P的最适pH为6.5,最适温度为55℃-65℃；在0.1%的SDS或10mM的Fe3+存在的条件下,CSN-P的活性完全被抑制,但在10M的尿素中仍有70%的酶活；该酶具有极高的耐热性,在80℃,90℃及100℃,半衰期分别为120min,60min和30min；在80℃保温60min,90℃保温30min和100℃保温15min后酶的残余活性仍有90%,比报道的Aspergillus fumigatus内源壳聚糖酶的热稳定性高。糖苷试剂盒染色、定点诱变和质谱分析表明CSN-P被O-糖基化,这可能是该酶在毕赤酵母中表达热稳定性提高的原因。50%脱乙酰度的壳聚糖水解实验表明该酶能很好地降解低脱乙酰度的壳聚糖为寡糖,24h后的水解产物主要为3-6糖,而且每个聚合度的寡糖含有不同个数的乙酰基团。以获得的低脱乙酰度壳寡糖为底物利用CLCD处理,结果显示CLCD能够很好地脱去壳寡糖上的乙酰基团。以上实验结果表明利用CSN-P和CLCD能够制备高脱乙酰度的壳寡糖。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 文献综述
• 1.1 甲壳素及壳聚糖结构与性质
• 1.1.1 甲壳素的结构与性质
• 1.1.2 壳聚糖的结构与性质
• 1.2 壳寡糖的性质与应用
• 1.2.1 壳寡糖的性质
• 1.2.1.1 壳寡糖的水溶性、吸湿性、保湿性
• 1.2.1.2 抗菌抑菌作用
• 1.2.1.3 减肥与降低胆固醇的作用
• 1.2.1.4 抗肿瘤活性
• 1.2.2 壳寡糖的应用现状
• 1.2.2.1 壳寡糖的食品中的应用
• 1.2.2.2 壳寡糖的化妆品中的应用
• 1.2.2.3 壳寡糖在生物医学领域的应用
• 1.2.2.4 壳寡糖在农业中的应用
• 1.3 壳寡糖的制备
• 1.3.1 化学法
• 1.3.1.1 酸水解法
• 1.3.1.2 氧化降解法
• 1.3.2 物理法
• 1.3.2.1 超声波和微波法
• 1.3.2.2 γ射线照射下辐射降解
• 1.3.2.3 光降解
• 1.3.3 酶降解法
• 1.3.3.1 甲壳素脱乙酰酶
• 1.3.3.2 专一性酶
• 1.3.3.2.1 壳聚糖酶
• 1.3.3.2.2 几丁质酶
• 1.3.3.2.3 溶菌酶
• 1.3.3.3 非专一性酶降解法
• 1.3.3.4 混合酶降解法
• 1.4 巴斯德毕赤酵母表达系统
• 1.4.1 表达菌株
• 1.4.2 表达载体
• 1.4.2.1 启动子
• 1.4.2.2 信号肽
• 1.4.2.3 选择性标记
• 1.4.2.4 外源基因的整合
• 1.4.3 外源蛋白的表达
• 1.4.3.1 外源蛋白的表达的步骤
• 1.4.3.2 外源蛋白的翻译后修饰
• 1.4.4 毕赤酵母表达外源蛋白的特点
• 1.4.4.1 毕赤酵母表达外源蛋白的优点
• 1.4.4.2 毕赤酵母表达外源蛋白的缺点
• 1.5 本文的研究意义与目的
• 第二部分 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.1.1 菌株
• 2.1.1.2 质粒表
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂和酶
• 2.1.3.1 试剂
• 2.1.3.2 酶
• 2.1.3.3 试剂盒
• 2.1.4 仪器和设备
• 2.1.5 实验主要涉及的溶液
• 2.1.5.1 质粒提取所用的溶液
• 2.1.5.2 SDS-PAGE溶液
• 2.1.5.3 其他溶液
• 2.1.6 引物
• 2.1.6.1 有关CSN-P的引物
• 2.1.6.2 有关CLCD的引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 PCR扩增目的基因
• 2.2.2 琼脂糖凝胶回收目的DNA片段
• 2.2.3 Muts处理PCR产物的方法
• 2.2.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.5 聚丙烯酰胺凝胶回收DNA
• 2.2.6 PCR产物的T4 DNA聚合酶处理
• 2.2.7 质粒DNA的抽提及纯化
• 2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.9 毕赤酵母感受态细胞制备
• 2.2.10 大肠杆菌的常规转化
• 2.2.12 外源基因在大肠杆菌中的诱导与表达
• 2.2.13 外源基因在毕赤酵母中的摇瓶诱导表达
• 2.2.14 外源基因在毕赤酵母中的发酵罐诱导表达
• 2.2.15 SDS-PAGE检测表达蛋白
• 2.2.16 目的蛋白的质谱验证
• 2.2.17 蛋白质浓度测定
• 2.2.18 壳聚糖酶的酶学性质分析
• 2.2.18.1 酶活测定方法
• 2.2.18.2 pH对壳聚糖酶活性的影响
• 2.2.18.3 温度对壳聚糖酶活性的影响
• 2.2.18.4 壳聚糖酶的热稳定性分析
• 2.2.18.5 各种添加剂对壳聚糖酶的影响
• 2.2.19 壳聚糖酶水解产物的分析
• 2.2.19.1 壳聚糖大规模水解条件
• 2.2.19.2 TLC分析壳聚糖酶水解产物
• 2.2.19.3 质谱分析壳聚糖酶水解产物
• 2.2.20 糖基化分析
• 第三部分 结果与分析
• 3.1. 壳聚糖酶的克隆、表达及酶学性质
• 3.1.1 CSN-P密码子优化前后clustalw2软件比对结果
• 3.1.2 CSN-P基因的合成
• 3.1.3 CSN-P毕赤酵母表达载体的构建
• 3.1.4 pHBM-CSN-P的毕赤酵母转化及转化子的鉴定
• 3.1.5 CSN-P在毕赤酵母中的表达
• 3.1.6 CSN-P酶学性质分析
• 3.1.6.1 pH对CSN-P的活性的影响
• 3.1.6.2 温度对CSN-P的活性的影响
• 3.1.6.2.1 CSN-P最适温度的测定
• 3.1.6.2.2 温度对CSN-P的热稳定性的影响
• 3.1.6.3 不同添加剂对CSN-P活性的影响
• 3.1.7 CSN-P的糖基化分析
• 3.1.8 CSN-P水解产物的成分分析
• 3.1.9 CSN-P对不同脱乙酰度壳聚糖水解效果的比较分析
• 3.2 脱乙酰酶的克隆、表达及酶学性质
• 3.2.1 CLCD密码子优化前后clustalw2软件比对结果
• 3.2.2 CLCD基因的合成
• 3.2.3 CLCD毕赤酵母表达载体的构建
• 3.2.4 pHBM-CLCD的毕赤酵母转化及转化子的鉴定
• 3.2.5 CLCD在毕赤酵母中的表达及SDS-PAGE分析
• 3.3 CLCD与CSN-P制备均匀脱乙酰度的壳寡糖
• 3.3.1 CLCD对CSN-P水解产物中壳三糖的作用
• 3.3.2 CLCD对CSN-P水解产物中壳四糖的作用
• 3.3.3 CLCD对CSN-P水解产物中壳五糖的作用
• 3.3.4 CLCD对CSN-P水解产物中壳六糖的作用
• 第四部分 讨论与展望
• 4.1 本研究制备壳寡糖方法的优点
• 4.1.1 CSN-P酶学性质的优越性
• 4.1.2 本研究制备壳寡糖技术路线的优越性
• 4.2 CSN-P水解壳聚糖及CLCD水解壳寡糖的作用机理
• 4.3 展望
• 4.3.1 CSN-P及CLCD毕赤酵母转化子高表达量的筛选
• 4.3.2 CLCD最佳水解条件的探索
• 4.3.3 CSN-P水解壳聚糖产物及CLCD水解壳寡糖产物的功能研究
• 参考文献
• 致谢