东亚钳蝎类氯离子通道神经毒素的研究

论文摘要

东亚钳蝎（Buthus martrnsii Karsch,BmK）是广泛分布于我国长江以北延伸到蒙古和朝鲜半岛的节肢动物。蝎毒中含有丰富的生理活性物质,其中主要活性成分是多肽（分子量3—9kDa）,包括神经毒素和酶。这些活性多肽可选择性的特异结合并调控可兴奋细胞膜上的离子通道。迄今为止,已有近百种神经毒素相继被纯化。根据其分子量大小,它们可被分为长链和短链两大类。长链毒素一般由约60-70个氨基酸组成,含4对二硫键,主要作用于可兴奋细胞膜的Na+通道,由于对长链毒素的认识和研究比较早,其中部分蛋白质一级结构、高级结构、生物药理功能以及基因结构都有较清楚的阐述。短链毒素则由28—40个氨基酸残基组成,含3或4对二硫键,根据结构的同源性,这些小分子多肽又可分成若干类型,它们主要作用于K+或（和）Cl-通道。2000年,在同一期Toxicon中,中科院生化所和武汉大学两个课题组同时报道了从东亚钳蝎中分离得到一个由35个氨基酸组成、含四对二硫键的多肽,并命名为BmK CT（或Bm-12）。从序列同源性来分析,它与从以色列蝎（Leiurus quinquestriatus）中分离到的氯离子通道毒素有66%的同源性,由于无相关的实验确证其生理活性,暂且认为是类氯离子通道毒素（chlorotoxin-like peptide）。 人脑神经胶质瘤是严重危害人类健康的恶性肿瘤。手术切割虽然是目前主要的治疗手段,但其复发性极强,已成为临床上治疗神经胶质瘤的极大障碍,因此,寻找新型有效的、靶向性防癌、抗癌药物已迫在眉

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1 蝎神经毒素概述
• 1.1 引言
• 1.2 蝎神经毒素的性质
• 1.2.1 一般理化性质
• 1.2.2 东亚钳蝎毒素的电生理特性
• 1.3 蝎毒素基因分子生物学研究
• 1.3.1 蝎毒素cDNA结构及翻译后的加工
• 1.3.2 蝎毒素基因组织结构及其mRNA的加工
• 1.4 蝎神经毒素的结构与功能的研究
• 1.4.1 长链蝎毒素的结构与功能研究
• 1.4.2 短链蝎毒素的结构与功能研究
• 1.5 蝎神经毒素的基因工程
• 1.5.1 重组蝎毒素在原核细胞中的表达
• 1.5.2 重组蝎毒素在真核细胞中的表达
• 2 电压门控氯离子通道（CLC）的研究进展
• 2.1 引言
• 2.2 CLC通道的种类与分布
• 2.3 CLC通道的特点
• 2.3.1 拓扑结构
• 2.3.2 CLC通道的双桶状结构
• 2.4 CLC通道的药理学性质
• 2.5 与CLC通道相关的疾病
• 2.6 神经胶质瘤细胞中氯通道的研究
• 3 论文的设计思路
• 3.1 实验背景：蝎氯离子通道毒素及其在治疗人脑神经胶质瘤中的潜在价值
• 3.2 实验的目的、技术方案流程及创新点
• 4 参考文献
• 第二章 利用搭桥PCR法人工优化合成东亚钳蝎类氯离子通道神经毒素（rBmK CTa）基因及其在大肠杆菌中的分泌表达、纯化与鉴定
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要试剂的配制
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 东亚钳蝎类氯离子通道神经毒素rBmK CTa全基因合成策略
• 2.3.2 表达质粒pExSecI-rBmK CTa和pExSecI-Bm-12的构建
• 2.3.3 rBmK CTa基因的诱导表达及表达量的对比分析
• 2.3.4 融合ZZ-rBmK CTa蛋白的纯化和切割
• 2.3.5 rBmK CTa蛋白的Western blot鉴定
• 3 实验结果
• 3.1 搭桥PCR法合成东亚钳蝎类氯离子通道神经毒素rBmK CTa基因
• 3.2 表达质粒pExSecI-rBmK CTa和pExSecI-Bm-12的构建
• 3.3 重组菌的诱导表达分析
• 3.4 分泌融合蛋白的表达与纯化
• 3.4.1 IgG-Sepharose亲和层析
• 3.4.2 Superdex75凝胶过滤层析
• 3.5 羟胺切割重组融合蛋白ZZ—rBmK CTa及其产物分离纯化
• 3.6 Western blot分析
• 3.7 蛋白表达量的分析
• 4 讨论
• 4.1 rBmK CTa基因的合成
• 4.2 东亚钳蝎类氯离子通道神经毒素蛋白的序列分析
• 4.3 rBmK CTa的表达及纯化分析
• 4.4 羟胺切割条件的分析
• 5 参考文献
• 第三章 东亚钳蝎毒素rBmK CTa的动物急性毒性和细胞毒性分析
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 动物急性毒性实验设计
• 2.2.2 细胞毒性实验设计
• 3 实验结果
• 50的确定'>3.1 切割后rBmK CTa对小鼠的急性毒性实验和LD₅₀的确定
• 3.2 Wistar大鼠的乳鼠脑海马区神经胶质细胞的提取和培养
• 3.3 预实验结果：纯化后的重组蛋白（ZZ—rBmK CTa）和切割后的rBmK CTa蛋白对正常鼠神经胶质细胞的毒性分析
• 3.4 人神经胶质瘤细胞株SHG-44的培养
• 3.5 rBmK CTa蛋白对正常鼠神经胶质细胞和人神经胶质细胞瘤SHG-44毒性的对比分析
• 3.6 rBmK CTa蛋白对人白血病细胞株HL-60的毒性作用
• 4 讨论
• 4.1 rBmK CTa毒素对人神经胶质细胞瘤SHG-44的毒性与其它蝎毒素细胞毒性的对比分析
• 4.2 rBmK CTa毒素在治疗人脑神经胶质瘤中的潜在价值
• 5 参考文献
• 第四章 膜片钳技术对东亚钳蝎类氯离子神经毒素（rBmK CTa）电生理学性质的确定
• 1 引言
• 1.1 膜片钳技术原理
• 1.2 膜片钳的记录模式
• 1.2.1 细胞吸附模式（On-cell mode）
• 1.2.2 膜内面向外模式（Inside-out mode）
• 1.2.3 全细胞模式（Whole-cell mode）
• 1.2.4 膜外面向外模式（Outside-side mode）
• 1.3 全细胞记录法基本实验操作
• 1.4 全细胞记录法的应用
• 1.4.1 离子通道宏观性质的分析
• 1.4.2 离子通道微观性质分析
• 1.4.3 离子通道的结构分析
• 1.4.4 载体运输的性质和机能分析
• 1.4.5 细胞内信息传递的分析
• 1.4.6 细胞膜电容的测定
• 1.4.7 对单细胞基因表达的分析
• 1.5 全细胞膜片钳记录法的不足
• 1.6 采用全细胞膜片钳技术确定东亚钳蝎rBmK CTa蛋白的性质
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 仪器
• 2.1.2 所需溶液的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 电极拉制及电极内液的充灌
• 2.2.2 实验参数的设置
• 2.2.3 细胞的准备和外理
• 2.2.4 膜片钳实验
• 2.2.5 数据处理
• 3 实验结果
• 3.1 rBmK CTa对人神经胶质瘤细胞株SHG—44氯离子通道的影响
• 3.2 rBmK CTa对人神经胶质瘤细胞株SHG—44钾离子通道的影响
• 3.3 rBmK CTa对人神经胶质瘤细胞株SHG—44钠离子通道的影响
• 4 讨论
• 4.1 人神经胶质瘤细胞膜上的氯离子通道
• 4.2 rBmK CTa的电生理学性质的确定
• 5 参考文献
• 第五章 东亚钳蝎毒素rBmK CTa的多克隆抗体制备及利用Far Western法探测其在SHG-44上的受体
• 1 引言
• 1.1 抗体概述
• 1.2 本章研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要仪器设备
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 试剂的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 抗原的制备
• 2.2.2 抗血清的制备
• 2.2.3 ELISA法检测抗体效价
• 2.2.4 东亚钳蝎毒腺总蛋白提取
• 2.2.5 东亚钳蝎毒总蛋白提取物的免疫印迹
• 2.2.6 Far Western法探测rBmK CTa在SHG—44上的受体蛋白
• 2.2.7 Pull Down实验获得受体蛋白
• 2.2.8 受体蛋白的N-端测序
• 3 实验结果
• 3.1 rBmK CTa抗血清的效价检测
• 3.2 东亚钳蝎的培养及毒腺总蛋白提取
• 3.3 东亚钳蝎毒总蛋白提取物的免疫印迹
• 3.4 Far Western法探测rBmK CTa在SHG—44上的受体蛋白
• 3.5 Pull Down实验获得受体蛋白
• 3.6 受体蛋白的N-端测序
• 4 讨论
• 4.1 rBmK CTa多克隆抗体的特异性
• 4.2 Far Western方法获得已知蛋白互相作用的未知受体的研究
• 4.3 蛋白质氨基酸测序的有关要求
• 4.4 35 kDa蛋白前6个氨基酸的Blast分析
• 5 参考文献
• 第六章 东亚钳蝎毒素rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠主要器官的影响
• 1 引言
• 1.1 石蜡切片技术
• 1.2 检测rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠各组织器官的影响的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 主要试剂的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 动物的处理
• 2.2.2 石蜡切片的制作
• 3 实验结果
• 3.1 rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠肾组织的影响
• 3.2 rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠大脑组织的影响
• 3.3 rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠脾脏组织的影响
• 3.4 rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠肝脏组织的影响
• 3.5 rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠腿部骨骼肌肉组织的影响
• 3.6 rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠肺组织的影响
• 3.7 rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠心脏组织的影响
• 4 讨论
• 4.1 东亚钳蝎毒素rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠七种组织器官的影响
• 4.2 以色列蝎（Leiurus Quinquestriatus）Chlorotoxin的药理学性质研究
• 4.3 石蜡切片法与其他技术方法的结合
• 4.3.1 与免疫学技术结合
• 4.3.2 石蜡包埋组织流式细胞仪DNA含量分析
• 4.3.3 石蜡切片标本是形态计量技术的基础
• 5 参考文献
• 第七章 东亚钳蝎毒素类氯离子通道神经毒素rBmK CTa蛋白的晶体生长条件的初步探索
• 1 引言
• 1.1 蛋白质结构测定的主要过程
• 1.2 蛋白质结晶
• 1.2.1 蛋白质结晶的原理
• 1.2.2 结晶方法和技术
• 1.3 相位问题
• 1.3.1 确定相位的主要方法
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 晶体生长的方法
• 2.2.2 晶体生长筛选条件的缓冲液配方
• 3 实验结果
• 3.1 rBmK CTa结晶条件的摸索
• 4 结果讨论
• 5 参考文献
• 总结与展望
• 附录Ⅰ 略语表
• 附录Ⅱ
• 一.个人简介
• 二.攻读博士学位期间发表的论文
• 三.主持和参与的科研项目
• 四.奖励情况
• 致谢
• 承诺书