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两个棉花14-3-3蛋白相互作用蛋白质的筛选与鉴定

2020-12-11阅读(634)

两个棉花14-3-3蛋白相互作用蛋白质的筛选与鉴定

论文摘要

在我们以前的研究中,发现了两个棉花14-3-3蛋白质在野生型和棉花纤维发育突变体中差异表达。其中一个（EST为gi|78344446）在无絮棉突变体-3DPA胚珠中上调表达,另一个（EST为gi|78324056）在徐州142陆地棉0DPA胚珠中表达却在突变体0DPA胚珠中不表达。表明14-3-3蛋白可能在纤维发育过程中起到调控作用。14-3-3蛋白是一类广泛存在于真核生物中高度保守的调控蛋白,主要通过与其它蛋白发生相互作用而发挥调控功能,因此探索14-3-3蛋白的功能应从研究与14-3-3蛋白互作的蛋白入手。本研究首先克隆了两个差异表达14-3-3蛋白质的编码基因全长,然后克隆到pET30原核表达载体上,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,IPTG诱导表达后用Ni-NTA树脂纯化出带有六联组氨酸标签的14-3-3蛋白。从徐州142、徐州142无絮突变体、TM-1和李氏纤维有限伸长突变体的-3、-1、0DPA胚珠和3、6DPA纤维中提取总蛋白并等量混合。以该混合蛋白为猎物蛋白质源,以两个14-3-3蛋白质为诱饵,分别进行pull-down试验,获得棉花胚珠与纤维总蛋白中与14-3-3蛋白互作的蛋白,双向电泳分离后进行质谱分析,鉴定14-3-3相互作用蛋白质,为进一步研究14-3-3蛋白在纤维发育中的作用打下了基础。主要研究结果如下：1、根据EST序列（gi|78344446和gi|78324056）,利用RACE技术,从陆地棉中克隆2个14-3-3蛋白编码基因全长,序列比对发现其中一个是新的棉花14-3-3蛋白家族基因,命名为Ghl4-3-3-like protein2（GenBank登录号：JF320796）,另一个序列与Gh14-3-3b （GenBank登录号：EU189221）仅相差三个氨基酸,可能是同一个蛋白。2、将两个14-3-3蛋白编码基因全长加上六联组氨酸标签并克隆至pET30原核表达载体上,IPTG诱导下,两个蛋白质均超量表达,SDS-PAGE电泳检测其分子量大约为30kD,与理论分子量一致。使用Ni-NTA镍柱纯化了这两个带6xHis标签的14-3-3蛋白。3、分别以这两个蛋白质为诱饵,采用pull-down方法从-3、-1、0DPA胚珠,3、6DPA纤维提取的混合蛋白质中分离14-3-3的相互作用蛋白质。对分离的蛋白质进行双向电泳,MALDI-TOF-TOF串联质谱鉴定蛋白质点。发现了23个与Gh14-3-3-like protein2相互作用的蛋白,其中7个得到了鉴定,蛋白质功能涉及到胁迫反应、蛋白质代谢、核苷酸代谢,细胞骨架、跨膜运输、能量代谢、信号转导和其他功能。发现了29个与Gh14-3-3b发生相互作用的蛋白,其中16个得到了鉴定,这些蛋白质功能涉及到胁迫反应,蛋白运输定位、蛋白代谢、蛋白质构象、细胞骨架、14-3-3蛋白单体和其他功能。这些14-3-3互作蛋白的鉴定为深入解析14-3-3蛋白在棉花纤维初始发育的调控机理提供了线索。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略词表
  • 本研究的目的和意义
  • 第一部分 文献综述
  • 第一章 棉纤维发育研究进展
  • 1 起始分化期
  • 2 伸长期/初生壁合成期
  • 3 次生壁合成期
  • 4 成熟期
  • 第二章 蛋白质组学概论
  • 1 蛋白质组学简介
  • 2 蛋白质组学基本研究方法
  • 2.1 蛋白质分离技术
  • 2.2 质谱技术
  • 2.3 生物信息学与蛋白质组学
  • 3 植物蛋白质组学及其研究进展
  • 3.1 亚细胞水平植物蛋白质组学研究进展
  • 3.2 植物发育蛋白质组学研究进展
  • 3.3 植物逆境蛋白质组学研究进展
  • 4 蛋白质相互作用研究方法
  • 第三章 14-3-3蛋白研究进展
  • 1 14-3-3 蛋白概述
  • 2 14-3-3 蛋白的结构
  • 3 14-3-3 蛋白定位
  • 4 14-3-3 蛋白主要功能
  • 4.1 14-3-3 蛋白与信号转导
  • 4.2 14-3-3 蛋白与代谢调节
  • 4.3 棉花14-3-3蛋白研究进展
  • 4.4 14-3-3 蛋白相互作用组学研究进展
  • 第二部分 研究报告
  • 第四章 两个棉花14-3-3蛋白基因的克隆
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料
  • 1.2 试验方法
  • 2 结果与分析
  • 2.1 棉花胚珠总RNA提取
  • 2.2 两个14-3-3蛋白基因的RACE
  • 3 讨论与结论
  • 第五章 两个Gh14-3-3的原核表达及纯化
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料
  • 1.2 试验方法
  • 2 结果与分析
  • 2.1 重组质粒载体的检测和验证
  • 2.2 蛋白质定量
  • 2.3 原核表达分析
  • 2.4 两个Gh14-3-3蛋白的诱导表达
  • 2.5 纯化结果
  • 3 讨论与结论
  • 3.1 讨论
  • 3.2 结论
  • 第六章 Gh14-3-3-like protein 2互作蛋白的筛选与鉴定
  • 1 材料与方法
  • 1.1 溶液配制
  • 1.2 试验方法
  • 2 结果与分析
  • 2.1 Gh14-3-3-like protein 2互作蛋白质点
  • 2.2 质谱鉴定结果
  • 3 讨论与结论
  • 3.1 Ghl4-3-3-like protein 2互作蛋白质功能分析
  • 3.2 结论
  • 第七章 Ghl4-3-3b互作蛋白的筛选与鉴定
  • 1 材料与方法
  • 1.1 溶液配制
  • 1.2 试验方法
  • 2 结果与分析
  • 2.1 Gh14-3-3b互作蛋白质点
  • 2.2 质谱鉴定结果
  • 3 讨论与结论
  • 3.1 Gh14-3-3b互作蛋白质功能分析
  • 3.2 结论
  • 第三部分 全文结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢

    • 相关论文文献

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