细胞色素P450 2C9酶的结构与催化功能关系的研究

论文摘要

细胞色素P4502C9 （CYP2C9）负责16%的临床常用药物的代谢,其基因多态性决定了相关药物代谢的个体和种族差异。体外酶催化能力测定结果表明,CYP2C9*13 （Leu90Pro）等位基因明显地降低了对不同CYP2C9酶底物药甲苯磺丁脲,双氯芬酸,氯诺昔康和化学发光底物虫荧光素H的代谢。我们将第90位氨基酸分别用性质类似或不同的氨基酸替代,在COS细胞系统中表达,并测定了酶催化活性。我们利用分子动力学模拟方法构建了CYP2C9各突变体的三维模型,分析90位氨基酸对突变体酶分子结构的影响,并且利用分子对接研究了突变体与底物之间的相互作用。实验结果表明突变体CYP2C9 L90E和L90P对双氯芬酸、氯诺昔康和化学发光底物的Vmax与野生型相比明显下降,模拟计算表明:在90位Leu被Glu和Pro替代后,底物进入酶催化中心的通道入口比野生型明显缩小,阻碍了底物进入活性部位,导致活力明显下降;而碱性氨基酸Arg的突变体L90R对三种底物的Vmax明显高于野生型。总之,第90位氨基酸的取代对CYP2C9的催化活性的影响是由于:底物进入通道入口的大小、活性部位口袋的形状、静电电荷分布和热稳定性。本研究表明非活性部位的氨基酸也会对酶蛋白的活性和稳定性产生重要影响。本论文利用杆状病毒载体的Sf9昆虫细胞表达系统,建立了CYP2C9、CPR的高效表达体系,构建了有效的P450-CPR酶反应体系。

论文目录

• 内容提要
• 1 前言
• 1.1 细胞色素P450 多态性
• 1.2 CYP2C9 基因多态性对药物代谢的影响
• 1.3 CYP2C9 对药物代谢的体外研究
• 1.4 杆状病毒介导的昆虫细胞表达体系
• 2 材料与方法
• 2.1 试剂和仪器
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 溶液的配制
• 2.1.3 仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 CYP2C9 酶COS-7 细胞表达体系的构建及活性测定
• 2.2.2 CYP2C9 酶昆虫细胞表达体系的建立及活性测定
• 3 结果与讨论
• 3.1 CYP2C9*13 在COS-7 细胞中的表达及对不同底物药代谢的影响
• 3.1.1 野生型CYP2C9 酶及其突变体在COS-7 细胞中的表达
• 3.1.2 野生型CYP2C9*1 及其突变体对不同底物药体外代谢能力的影响
• 3.2 突变体CYP2C9 L90P, L90E, L90W, L90Q, L901, L90R 和L90G 对酶催化能力的影响
• 3.2.1 七种CYP2C9 酶90 位突变体的体外催化活性的测定
• 3.2.2 七种CYP2C9 酶90 位突变体的分子动力学模拟研究
• 3.2.3 讨论
• 3.3 CYP2C9*13 在昆虫细胞中的表达及其代谢活力测定
• 3.3.1 CYP2C9*13 在昆虫细胞中的表达
• 3.3.2 CYP2C9*13 酶活测定
• 3.3.3 讨论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的学术论文
• 致谢
• 中文摘要
• ABSTRACT