14-脱羟基-14-亚甲基雷公藤内酯醇的微生物转化研究

论文摘要

中药雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f）是我国近年来发现的一种新的药物资源,临床被应用于治疗肾小球肾炎、类风湿关节炎、麻风病、系统性红斑狼疮、及皮肤病和自身免疫性疾病。雷公藤内酯醇是中药雷公藤中主要二萜类活性化合物。大量研究表明雷公藤内酯醇可有效地治疗自身免疫性疾病并具有较强的抗白血病和抗肿瘤活性。但由于雷公藤内酯醇的毒副作用较大,使它们的应用受到了限制。为了发现活性更好、毒副作用更小的活性化合物,人们一直在寻找有效的方法对这类化合物进行结构修饰和改造。目前,生物转化已成为天然产物结构修饰和改造的有利工具,它是利用生物代谢过程中产生的酶对外源性物质进行结构修饰和改造的化学反应。与化学方法相比,它具有选择性高、条件温和、无污染、成本低、副产物少等优点；可以完成一些用化学方法难以进行的反应。利用生物体系作为生物催化剂可以对天然产物的结构进行修饰,从而得到一些结构新颖的先导化合物进行药物开发。14-脱羟基-14-亚甲基雷公藤内酯醇（T-144）是由雷公藤内酯酮经一系列化学反应得到的一种化合物,其化学结构式为C21H2405,分子量为356.41。经药效学评价试验发现,它对人卵巢癌SK-OV-3细胞、人乳腺癌MDA-MB-468细胞和人前列腺癌PC-3细胞均具有明显的抑制作用。本论文对雷公藤内酯醇的衍生物T-144进行了生物转化研究,以期寻找到新的、活性更高的化合物,并对转化产物进行了分离、鉴定。本研究通过静息细胞法和PDA培养基培养法对16株微生物进行转化筛选,最终确定使用PDA培养基进行培养转化T-144,并从中筛选出转化效果稳定,转化完全且多样性较好的短刺小克银汉霉（Cunninghamella blakesleana AS3.970）作为T-144的转化菌株,其转化产物B1、B2、B3经LC-MS检测分子量分别为372、374、390。对短刺小克银汉霉的转化条件进行优化,确定最佳转化条件：以含10%DMSO的乙醇溶解T-144,25℃条件下转化；经实验发现得到产物B1的最佳转化时间为24小时,得到产物B2、B3的最佳转化时间为96小时。并且根据实验过程中各产物的变化发现：底物T-144首先在短刺小克银汉霉的作用下被转化为产物B1和B2,随着转化的继续进行,产物B1又被转化为产物B3。进行T-144生物转化的大量制备,经萃取得到转化产物的粗提物。通过硅胶预处理去除部分杂质,初步分离得到T-144和产物B1的混合物以及产物B2和B3的混合物。采用高效液相制备色谱法分离转化产物,并对制备条件进行优化,最终确定最佳的制备分离条件：甲醇与水的体积比70：30用于制备分离T-144与B1,以50：50制备分离B2与B3;流速为1.5mL/min,上样量80μL/0.32mg.将制备分离得到的纯度在97.5%以上的三种产物分别进行NMR检测以确定三种产物的结构。发现产物B1为第19位C上加入一个羟基；产物B2是在T-144第14位和第21位C之间的双键上加入一分子的水,该产物存在两种结构分别为B2-a和B2-b；B3则是在B1的基础上在其第14位和第21位C之间的双键上加入一分子的水。产物B1、B3和B2-b为新化合物,可能成为新药研究的前导化合物。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 第一章 综述
• 1.1 雷公藤简介
• 1.1.1 化学成分
• 1.1.2 药理作用
• 1.1.3 毒副反应
• 1.1.4 临床作用
• 1.1.5 制剂研究
• 1.2 雷公藤内酯醇及其衍生物
• 1.2.1 雷公藤内酯醇的来源
• 1.2.2 雷公藤内酯醇的化学改造研究
• 1.2.3 雷公藤内酯醇其它方面的研究
• 1.3 14-脱羟基-14-亚甲基雷公藤内酯醇简介
• 1.4 生物转化综述
• 1.4.1 生物转化在天然药物合成中的应用
• 1.5 立题依据
• 第二章 14-脱羟基-14-亚甲基雷公藤内酯醇（T-144）的微生物转化研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 仪器
• 2.1.2 材料
• 2.1.3 （高效液相色谱）HPLC对样品的分析
• 2.2 转化14-脱羟基-14-亚甲基雷公藤内酯醇（T-144）的微生物的筛选
• 2.2.1 预实验
• 2.2.2 发酵液处理
• 2.2.3 结果与分析
• 2.3 本章小结
• 第三章 T-144的微生物转化条件优化
• 3.1 仪器与材料
• 3.1.1 仪器
• 3.1.2 材料
• 3.1.3 HPLC对样品的分析
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 发酵滤液对T-144的生物转化的影响
• 3.2.2 不同溶剂溶解底物后对转化的影响
• 3.2.3 不同温度对转化的影响
• 3.2.4 最佳转化条件下转化液中pH的变化
• 3.2.5 最佳转化条件下转化液中各组分的变化
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 发酵滤液对T-144的生物转化的影响
• 3.3.2 不同溶剂溶解底物后对转化的影响
• 3.3.3 不同温度对转化的影响
• 3.3.4 最佳转化条件下转化液中pH的变化
• 3.3.5 最佳转化条件下转化液中各组分变化
• 3.4 本章小结
• 第四章 T-144生物转化产物的分离纯化及结构验证
• 4.1 仪器与材料
• 4.1.1 仪器
• 4.1.2 材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 粗提物的制备
• 4.2.2 硅胶柱初分离
• 4.2.3 制备分离转化产物
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 硅胶柱初分离
• 4.3.2 高效液相制备条件优化
• 4.3.3 经制备液相分离后三种转化产物的HPLC和NMR图谱分析
• 4.4 本章小结
• 全文讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的专利
• 致谢