多拉菌素产生菌基因组重排育种

论文摘要

多拉菌素是新一代大环内酯类抗生素,属于阿维菌素第三代衍生物。其抗寄生虫范围广泛,作用独特,与其它抗寄生虫药物无交叉耐药性,效果好,是目前具有开发潜力的兽用抗寄生虫药物。本论文通过基因组重排技术选育多拉菌素高产菌株,用响应面优化发酵培养基,同时采用单因素方法优化多拉菌素高产菌株发酵条件,为大规模生产提供可靠的工艺参数。首先对原始菌株进行分离复壮,采用传统的紫外辐射和亚硝基胍诱变选育高产菌株做为基因组重排育种的出发菌株。同时优化了原生质体制备和融合条件。最佳方法为添加0.5%甘氨酸的YEME作为制备原生质体的菌丝培养基,培养20 h后收集菌丝体用加入35颗玻璃珠的250 ml摇瓶、250 rpm振荡45 min打碎菌丝体,3 mg/ml溶菌酶、30℃作用30 min。原生质体制备率和再生率分别达到了88.9%、4.4%。最适融合条件为40%的PEG4000作用3 min,融合率为8.3‰。将诱变得来的高产菌株制备成原生质体,分别采用紫外照射200 s、60℃温浴40 min灭活后融合,用5μg/ml的链霉素抗性筛选第一轮基因组重排高产菌株。第一轮筛选得到的高产菌株作为第二轮基因组重排的出发菌株,如此重复进行4轮基因组重排。链霉素的抗性浓度分别是5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml。最后得到一株多拉菌素产量为547 mg/l的遗传稳定菌株F4-120。其产量分别是原始菌株（103 mg/l）和第一轮重排出发菌株最高产量（147 mg/l）的531.07%、372.11%。同时比较了原始菌株和重组菌株的发酵参数。采用响应面方法优化了基因组重排菌株F4-120的发酵配方,得到玉米淀粉、蛋白胨和碳酸钙为显著影响因素,优化后的浓度分别为118.9 g/l、17.16 g/l和10.18 g/l。多拉菌素产量达到672 mg/l,与优化前相比提高了23%。另外本论文确定了多拉菌素产生菌的发酵温度、发酵培养基初始pH、装量、种子培养时间和移种量。考察了敏感度、前体添加时间和浓度及发酵过程中的补水时间,结果表明多拉菌素产生菌对剪切力很敏感,在发酵第一天和第六天分别添加0.1%和0.06%前体环己烷甲酸钠能促进产素,发酵过程第四天补与蒸发量同等体积的无菌自来水可以提高产素总量。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 多拉菌素概述
• 1.1.1 多拉菌素的化学结构与理化性质
• 1.1.2 多拉菌素生物合成途径
• 1.1.3 多拉菌素的作用机理和临床应用
• 1.2 基因组重排育种研究概况
• 1.2.1 基因组重排技术的原理和方法
• 1.2.2 筛选目的表型的方法
• 1.2.3 基因组重排育种的应用
• 1.2.4 基因组重排技术的优点
• 1.3 响应面方法简介
• 1.4 本研究的主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 出发菌株
• 2.1.2 主要试剂及仪器
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌种保藏
• 2.2.2 菌种培养和发酵
• 2.2.3 菌种选育
• 2.2.4 原生质体制备
• 2.2.5 原生质体灭活
• 2.2.6 原生质体融合
• 2.2.7 基因组重排
• 2.2.8 重组菌株稳定性考察
• 2.3 分析方法
• 2.3.1 菌丝体浓度测定
• 2.3.2 氨基氮含量测定
• 2.3.3 葡萄糖含量和pH 测定
• 2.3.4 多拉菌素的含量测定
• 3 结果和讨论
• 3.1 原生质体制备
• 3.1.1 菌丝培养基选择
• 3.1.2 菌体菌龄
• 3.1.3 菌丝打碎
• 3.1.4 甘氨酸浓度
• 3.1.5 酶浓度
• 3.1.6 酶解时间
• 3.1.7 酶解温度
• 3.2 原生质体融合
• 3.2.1 双亲灭活
• 3.2.2 融合条件
• 3.3 基因组重排
• 3.3.1 重排出发菌株选择
• 3.3.2 出发菌株对链霉素的最低抑制浓度
• 3.3.3 基因组重排流程
• 3.3.4 多拉菌素产量提高
• 3.3.5 原始菌株和高产重组菌株的HPLC 图谱
• 3.3.6 对照试验
• 3.3.7 重组高产菌株稳定性
• 3.3.8 原始菌株和重组菌株发酵参数比较
• 4 多拉菌素产生菌发酵特性研究
• 4.1 多拉菌素发酵过程基本操作流程
• 4.2 平板及斜面固体培养基的确定
• 4.3 发酵培养基优化
• 4.3.1 发酵培养基碳源实验
• 4.3.2 发酵培养基氮源实验
• 4.3.3 响应面法优化发酵培养基
• 4.4 发酵条件实验
• 4.4.1 发酵培养温度实验
• 4.4.2 发酵培养基初始pH 对产量的影响
• 4.4.3 摇瓶装量对多拉菌素合成的影响
• 4.4.4 种龄和移种量对多拉菌素发酵的影响
• 4.4.5 剪切力对多拉菌素发酵影响的实验
• 4.4.6 前体添加量和时间对多拉菌素产量的影响
• 4.4.7 发酵过程中补水实验
• 4.5 实验结果
• 4.5.1 平板及斜面固体培养基确定
• 4.5.2 发酵培养基配方优化
• 4.6 发酵条件优化结果
• 4.6.1 发酵温度确定
• 4.6.2 发酵液初始pH 值对多拉菌素产量的影响
• 4.6.3 摇瓶不同装量实验结果
• 4.6.4 种龄和移种量对多拉菌素合成的影响
• 4.6.5 剪切力对多拉菌素发酵的影响
• 4.6.6 前体添加时间和浓度对多拉菌素的影响
• 4.6.7 发酵过程中摇瓶补水实验结果
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文