山莨菪碱抗休克作用的α7尼古丁受体和β-arrestins抗炎机制

论文摘要

目的:山莨菪碱是中国科学家1965年从茄科植物唐古特莨菪中提取出的生物碱,其人工合成品为654-2。山莨菪碱是托品酸和有机碱形成的酯类,结构与阿托品和东莨菪碱相类似,在托品基的6位炭原子上有不对称的羟基。山莨菪碱属于非选择性的毒蕈碱受体阻断剂,能够阻断M1—M5受体亚型。因此,山莨菪碱有一系列相似于阿托品的药理作用如抑制唾液分泌、抑制胃酸和汗液分泌,抑制胃肠蠕动及膀胱收缩、散瞳、扩张支气管。临床上已经用于由平滑肌痉挛、胃、十二指肠溃疡、胆道痉挛而引起的疼痛,类风湿性关节炎,胃溃疡,急性肾小球肾炎,偏头痛,过敏性紫癜,肺炎、有机磷酸酯类中毒的解救等多种疾病的治疗。自1965年以来,山莨菪碱被用于治疗循环性休克,特别是感染性休克的治疗取得了很好的治疗效果,如北京友谊医院儿科使用山莨菪碱治疗爆发型流行性脑脊髓膜炎,使死亡率从66.9%下降到12.4%,用山莨菪碱治疗中毒性细菌性痢疾,使死亡率从20-30%下降到0.5%。目前关于山莨菪碱抗休克的机制主要包括改善微循环;抑制血栓形成和纤维蛋白溶解作用;稳定溶酶体及抑制组织蛋白酶等,但是其相关的分子生物学机制很少报道。Wang等报道乙酰胆碱与巨嗜细胞上尼古丁受体结合能够抑制内毒素诱导的炎性因子TNFα,IL-1β,IL-6,IL-18等分泌。进一步研究发现乙酰胆碱的作用主要是通过与巨嗜细胞上的α7尼古丁受体结合,通过细胞内一系列的信号传递,最终抑制了Jak2-STAT3和NF-κB信号的激活,从而抑制了炎症因子的产生。在内毒素休克大鼠模型中,切断迷走神经能够明显加重内毒素诱导的休克反应,动物对内毒素的致死效应更加敏感。直接刺激迷走神经能够降低内毒素血症大鼠血浆和组织中TNFα和IL-6的含量,阻止血压的持续下降,减缓内毒素引起的低血压休克的发生时相。由于乙酰胆碱是迷走神经末梢分泌的主要神经递质,因此,他们把这条通路命名为胆碱能抗炎通路（cholinergic anti-inflammatory pathway）。胆碱能抗炎通路是通过神经来调节炎症反应程度的重要通路。山莨菪碱是非选择性的M受体阻断剂,因此,我们的第一个假设是:山莨菪碱通过阻断M受体,使迷走神经分泌的乙酰胆碱更多的与α7尼古丁受体结合激活了胆碱能抗炎通路,发挥了抗休克作用。β-arrestins是一组多功能的小分子蛋白质,它的经典作用是参与G蛋白偶联受体的脱敏。但是近年来的研究发现,β-arrestins作为脚手架蛋白,也参与了许多非G蛋白偶联受体激活的信号传导,如ERK,JNK,p38,Akt和PI3激酶信号通路等,因此β-arrestins也参与了趋化作用,凋亡作用及肿瘤转移等过程。2006年,Nature上报道了β-arrestins可以和TRAF6结合,负向调节内毒素休克时的信号传导通——TLR-IL-1R（toll-likereceptor-interleukin-1 receptor）信号通路,最终抑制转录因子NF-κB及AP-1的活化,从而抑制炎症因子的产生。此外,Witherow等报道了β-arrestins,特别是β-arrestin-1能够直接与NF-κB的抑制因子IKBα结合,使得IKBα-NF-κB复合体滞留在胞浆中,从而阻止NF-κB进入细胞核而抑制其活化。Gao等研究发现β-arrestin-2能够与IkBα结合,抑制IkBα的磷酸化降解,从而抑制NF-κB信号的激活及炎症因子的表达,并发现刺激β2肾上腺素能受体能够加强β-arrestin2-IkBα复合体的稳定,从而为交感系统的抗炎作用提供了理论依据。Luan等的研究发现β-arrestin-2能够与IkBα结合,抑制紫外线照射引发的NF-κB信号活化。阮等的研究发现在人脐静脉内皮细胞,山莨菪碱能够抑制内毒素诱导的内皮细胞活化,山莨菪碱也能够完全阻断内毒素诱导的NF-κB活化。因此,我们的第二个假设是:山莨菪碱增加了β-arrestins蛋白的表达,β-arrestins蛋白表达增加抑制了NF-κB信号的活化,参与了与山莨菪碱的抗休克作用。方法:本研究以内毒素诱导的休克为模型,研究了α7尼古丁受体阻断剂甲基牛扁碱对山莨菪碱抗休克作用的影响;在受体结合实验中,利用激光共聚焦观察了山莨菪碱对乙酰胆碱与α7尼古丁受体结合的影响;在内毒素诱导的RAW264.7巨嗜细胞,利用分子生物学技术研究了山莨菪碱对RAW264.7巨嗜细胞β-arrestin-1蛋白表达的影响及β-arrestin-1蛋白在山莨菪碱抗休克中的作用。结果:第一部分:山莨菪碱通过激活胆碱能抗炎通路发挥了抗休克作用1、α7尼古丁受体特异性阻断剂甲基牛扁碱显著地阻断了山莨菪碱对大鼠内毒素休克低血压的改善作用,同时也阻断了山莨菪碱降低内毒素休克大鼠血清和肝脏炎性细胞因子TSFα和IL-1β水平的作用;甲基牛扁碱也能显著地阻断山莨菪碱改善内毒素休克小鼠存活率的作用;在单侧迷走神经切断的小鼠模型上,山莨菪碱的抗休克作用下降;α7尼古丁受体基因敲除的小鼠与其野生对照小鼠相比,山莨菪碱降低内毒素休克小鼠血清中TNFα和IL-1β的作用显著下降。这些结果说明α7尼古丁受体参与了山莨菪碱的抗休克作用。2、受体结合实验结果说明,在RAW264.7巨嗜细胞,山莨菪碱能够通过阻断M受体,增加乙酰胆碱与α7尼古丁受体结合的数量;以α7尼古丁受体基因敲除小鼠和其野生对照小鼠的腹腔巨嗜细胞为模型,发现在野生小鼠的腹腔巨嗜细胞,山莨菪碱能够加强乙酰胆碱抑制内毒素诱导TNFα分泌的作用,但是在α7尼古丁受体基因敲除小鼠的腹腔巨嗜细胞,山莨菪碱则没有此作用。第二部分:山莨菪碱通过增加β-arrestin-1蛋白的表达发挥了抗休克作用1、在培养的RAW264.7巨嗜细胞,山莨菪碱能够剂量和时间依赖性地上调β-arrestin-1蛋白和mRNA表达;山莨菪碱的这个作用能够被蛋白质合成抑制剂放线菌酮和防线菌素D阻断;山莨菪碱也能够显著的逆转由内毒素引起的细胞内cAMP含量下降;用cAMP-PKA信号通路的特异性阻断剂H-89预处理细胞后,发现山莨菪碱上调β-arrestin-1的作用被阻断;以内毒素诱导的休克小鼠为模型,山莨菪碱能够显著增加脾脏β-arrestin-1的表达。2、在β-arrestin-1干扰的RAW264.7巨嗜细胞,山莨菪碱抑制内毒素诱导的TNFα和IL-1β分泌的作用显著下降。结论:山莨菪碱通过阻断M受体,使更多的迷走神经分泌的乙酰胆碱与巨嗜细胞上的α7尼古丁受体结合,从而激活了胆碱能抗炎通路,发挥了抗休克作用。此外,山莨菪碱能够通过cAMP-PKA信号通路增加β-arrestin-1蛋白的表达,β-arrestin-1蛋白在参与了山莨菪碱的抗休克作用。

论文目录

• 中文摘要
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• 中英文缩写词表
• 前言
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 展望
• 附录
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表论文
• 综述