生长素、肥胖抑素在动脉粥样硬化中的作用及机制研究

论文摘要

生长素（Ghrelin）是迄今发现的唯一的生长激素促分泌剂受体（GHS-R）的内源性配体,在增强食欲,促进胃肠功能以及调节能量代谢等方面发挥重要的作用。近年来研究发现Ghrelin除了特异性的促进生长激素释放外,还与多种病理生理过程密切相关,如肥胖、心血管疾病、糖尿病及衰老。近来从大鼠的胃组织中成功分离出一段Ghrein相关肽命名为肥胖抑素（obestatin）,研究证实Obestatin具有和Ghrelin相反的作用,Obestatin的发现进一步拓展了Ghrelin的相关领域,有研究报道Obestatin水平在冠心病体内升高,Obstatin可以加重离体心脏的缺血再灌注损伤。但迄今未见有关Ghrelin和Obestatin对动脉粥样斑块消退的影响的相关报道。为此,本研究拟从以下几个方面探讨Ghrelin和Obestatin对动脉粥样硬化的影响:①离体研究Ghrelin和Obestatin对AngⅡ诱导的脐静脉内皮细胞NO释放,细胞内氧化应激、内皮细胞增殖和迁移、炎症因子产生的影响及信号通路研究;②在体研究Ghrelin对动脉粥样硬化小鼠动脉粥样硬化斑块和炎症因子以及血管壁NFκB的影响第一章:生长素对人脐静脉内皮细胞功能影响及机制研究目的:观察生长素对AngⅡ所致的脐静脉内皮细胞活性氧生成、NO释放,内皮细胞增殖、迁移、单核内皮细胞粘附和TNFα、IL-8、MCP-1水平和基因表达的作用以及涉及的信号通路。方法:①采用不同浓度的AngⅡ（0（?）24小时）孵育HUVEC-12,获得最佳观察点,并观察(10-9（?）10-6mol/L)生长素对AngⅡ损伤的影响。②加入MAPK信号通路抑制剂PD98059（25μmol/L）、GHSRla受体阻断剂（[Dys3]GHRP-625μmol/L）、NFκB通路抑制剂PDTC1μmol/L预处理HUVEC-12细胞观察对生长素影响AngⅡ诱导的内皮细胞损伤的作用。采用硝酸还原酶法测细胞培养上清NO;WST-8法测细胞增殖;Transwell小室测细胞迁移;荧光探针法测细胞内的活性氧生成。RT-PCR法测细胞中TNFα、IL-8、MCP-1基因表达;ELISA法测细胞培养上清TNFα、IL-8、MCP-1浓度;Western blot测细胞中totalNFκBp65,ERK1/2、total Akt、p-Akt、P-NFκBp65,P-ERK1/2、eNOS蛋白表达。结果:①AngⅡ呈浓度和时间依赖性地抑制HUVEC-12细胞分泌NO,生长素呈浓度依赖性地逆转AngⅡ对NO生成的减少。PD98059预处理对AngⅡ诱导的NO生成无影响,而[Dys3]GHRP-6（25μmol/L）处理阻断生长素对NO生成的升高作用。②AngⅡ呈浓度和时间依赖性地促进内皮细胞迁移和增殖。生长素抑制AngⅡ引起的内皮细胞迁移和增殖呈浓度的时间依赖性。PD98059（25μmol/L）预处理可以抑制AngⅡ促内皮细胞迁移和增殖作用,[Dys3]GHRP-6（25μmol/L）预处理阻断生长素对内皮细胞迁移和增殖的抑制作用。③AngⅡ浓度和时间依赖性地促进HUVEC-12细胞ROS生成增加。生长素呈浓度依赖性抑制AngⅡ对ROS生成的促进作用。[Dys3]GHRP-6预处理可阻断生长素对ROS生成的抑制作用。④生长素可浓度依赖性地减弱AngⅡ诱导的TNFα、IL-8、MCP-1的释放和时间依赖性地减弱这些炎症因子的基因表达。[Dys3]GHRP-6预处理阻断生长素对TNFα、IL-8、MCP-1释放和基因表达的影响。⑤生长素可增加内皮细胞pAkt,eNOS表达,减少p-NFκBp65和p-ERK1/2的表达,同时减少单核内皮细胞粘附。结论:生长素可抑制AngⅡ诱导的内皮细胞损伤、炎症反应和氧化应激,其机制涉及PI3K/Akt途径,影响ERK1/2和NFκB通路活化。第二章肥胖抑素对人脐静脉内皮细胞功能的影响及机制研究目的:观察肥胖抑素对脐静脉内皮细胞活性氧形成、内皮细胞NO释放、内皮细胞增殖、迁移,单核内皮细胞粘附和TNFα、IL-8、MCP-1水平和基因表达的作用以及涉及的信号通路。方法:①采用不同浓度AngⅡ（0（?）24h）孵育HUVEC-12细胞,获得最佳观察点,并观察(1010-10-7mol/L)obestatin对AngⅡ损伤的影响。②加入MAPK信号通路抑制剂PD98059预处理HUVEC-12细胞后再用肥胖抑素和AngⅡ孵育HUVEC-12,采用方法同第一章。结果:①AngⅡ抑制NO释放同第一章,肥胖抑素抑制HUVEC-12细胞释放NO。肥胖抑素进一步加重AngⅡ引起的HUVEC-12细胞释放NO减少,呈浓度和时间依赖性。肥胖抑素抑制eNOS表达。有可能通过抑制PI3K途径抑制NO分泌。②肥胖抑素呈剂量和时间依赖性地增加内皮细胞的增殖,相同剂量生长素可以拮抗肥胖抑素促内皮细胞增殖作用。③肥胖抑素对AngⅡ诱导的内皮细胞迁移起促进作用,而本身对内皮细胞迁移没作用。PD98059能阻断肥胖抑素+AngⅡ引起的内皮细胞迁移作用。④肥胖抑素浓度依赖和时间依赖性地刺激的HUVEC-12细胞ROS增加。⑤肥胖抑素时间和浓度依赖性地增加AngⅡ诱导的HUVEC-12细胞TNFα、IL-8、MCP-1水平和基因表达。PD98059和PDTC能阻断肥胖抑素增加AngⅡ诱导的HUVEC-12细胞TNFα、IL-8、MCP-1水平和基因表达的作用。⑥肥胖抑素增加p-ERK1/2、p-NFκBp65蛋白表达,减少p-AKt、eNOS蛋白表达和促进单核内皮细胞粘附,及促进AngⅡ诱导的单核内皮细胞粘附。结论:肥胖抑素促进AngⅡ诱导的HUVEC-12内皮细胞损伤、炎症反应和氧化应激,其机制可能与抑制PI3K/Akt、激活ERK1/2、NFκB通路有关。第三章生长素对apoE基因敲除小鼠动脉粥样斑块的影响目的:观察生长素对apoE-/-小鼠血浆IL-8、MCP-1、TNFα水平和血管壁NFκBp65表达及动脉粥样斑块的影响。方法:8周龄apoE-/-小鼠饲以西方类型膳食12周建立动脉粥样硬化模型。遗传背景相同的8周龄C57BL/6J小鼠饲以同类型膳食作对照。第8周时模型组分为腹腔内注射生长素（100μg/kg）组和注射生理盐水（0.1ml）组,C57BL/6J小鼠亦给予生理盐水（0.1ml）腹腔内注射。第12周时眼眶取血,分离血浆ELISA法测IL-8、MCP-1、TNFα,处死小鼠取主动脉进行大体标本观察和HE及油红O染色、免疫组化分析。结果:①体视显微镜HE和油红O染色及图像分析仪测量显示:C56BL/6J小鼠无动脉斑块形成,apoE-/-组和ApoE-/-+生长素组均有动脉斑块形成,但apoE-/-+生长素组比ApoE-/-组斑块减少。②与C57BL/6J小鼠相比,apoE-/-小鼠血浆中TNFα、IL-8、MCP-1水平升高。而apoE-/-+生长素组较apoE-/-组TNFα、IL-8、MCP-1显著降低。③与C57BL/6J小鼠相比,apoE-/-小鼠血管壁NFκBp65免疫组化阳性细胞积分光密度值明显升高。生长素可明显降低apoE-/-小鼠主动脉NFκBp65表达。结论:生长素通过抑制炎症反应减少ApoE-/-小鼠动脉粥样斑块形成。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词简表
• 前言
• 第一章 生长素对人脐静脉内皮细胞功能的影响及机制研究
• 前言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 第二章 肥胖抑素对脐静脉内皮细胞功能的影响及机制研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 第三章 生长素对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块与炎症因子的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 在读期间发表论文