高低油脂含量大豆成熟期胚抑制消减cDNA文库构建及差异基因分析

论文摘要

大豆（Glycine max L.）是当今世界上重要的食用油来源之一。我国是大豆的原产地,种质资源丰富、种类多、品质高、遗传多样性高。目前,在大豆脂肪酸代谢机理方面已经有一些研究,但这些研究多是从单个基因的角度,去研究脂肪酸的代谢途径,少有从大豆胚发育的角度,去研究脂肪酸合成代谢网络的报道。如何从这一复杂生化体系中找到关键的调控基因,阐明其生物学功能并朝符合人类需求的方向进行改造,对改良大豆脂肪酸组成提高油脂含量具有重要意义。“中豆32”和“油春02-6”是我国特有的大豆品种,两个品种的油脂含量分别为22.48%、17.72%,蛋白质含量分别为37.07%、44.07%,差异非常明显。利用抑制性消减杂交这一成熟的高效获得差异表达基因的技术,比较两个大豆品种发育过程中的基因表达差异,有利于筛选出调控油脂代谢的关键基因,为后期研究打下坚实的基础。课题主要研究如下:利用抑制性消减杂交技术构建了以“中豆32”开花后36天胚为检测对象的正向cDNA文库和以“油春02-6”开花后36天胚为检测对象的反向cDNA文库。正反向抑制消减文库消减效率均在25以上,消减文库克隆经菌落PCR检测,有效重组率在90%以上,其中插入的cDNA片段大小在100bp到900bp之间,平均大小在434bp左右,构建比较成功。通过对文库进行PCR和点杂交筛选,挑取了1337个阳性克隆进行测序,利用生物信息学对测序信息进行归并和分类,获得了32个在“中豆32”中高表达的特异基因和30个在“油春02-6”中高表达的差异基因。这些基因涉及到了蛋白质和油脂的合成、降解和转运,能量代谢以及胁迫响应几个方面。通过对这62个基因进行不同组织表达情况的检测,得到了6个在胚中特异表达的基因,这6个基因分别为蔗糖结合蛋白、大豆种子成熟蛋白PM34、p24油脂蛋白B、脂氧合酶1、β-1,4-甘露糖苷酶和GDSL脂肪分解酶。为检测这6个基因在胚不同发育阶段的表达情况,用同样的方法分析了它们的时序表达情况。此外,还利用荧光定量PCR技术进一步分析了这六个基因在两个大豆品种中的定量差异。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 引言
• 1.1 植物脂肪酸代谢的研究概况
• 1.2 抑制性消减杂交技术产生的背景
• 1.3 抑制性消减杂交的主要原理
• 1.4 抑制性消减杂交的基本过程
• 1.5 抑制性消减杂交的主要优缺点
• 1.5.1 抑制性消减杂交的主要优点
• 1.5.2 抑制性消减杂交的主要缺点
• 1.6 抑制性消减杂交的应用
• 1.7 研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 材料标记
• 2.2.2 取材
• 2.2.3 总RNA的提取
• 2.2.4 mRNA的纯化
• 2.2.5 RNA的反转录
• 2.2.6 抑制性消减杂交
• 2.2.7 连接转化
• 2.2.8 克隆涂板
• 2.2.9 菌液PCR筛选
• 2.2.10 点杂交
• 2.2.11 克隆测序及分析
• 2.2.12 实时荧光定量PCR校正内参
• 3 结果与分析
• 3.1 大豆种子成分测定
• 3.2 总RNA的提取
• 3.2.1 构建消减杂交文库的总RNA提取
• 3.2.2 检测时序特异的总RNA提取
• 3.2.3 检测组织特异的总RNA提取
• 3.3 用于特异性检测的样品的反转录
• 3.3.1 组织特异模板反转录检测
• 3.3.2 时序特异模板反转录检测
• 3.4 消减杂交文库构建
• 3.4.1 接头连接效率分析
• 3.4.2 消减杂交效率的PCR检测
• 3.5 PCR检测克隆片段插入状况
• 3.6 阳性克隆的点杂交筛选
• 3.7 测序结果统计
• 3.8 特异基因信息
• 3.9 实时荧光定量PCR内参的校正
• 3.10 差异基因的RT-PCR检测
• 3.10.1 差异基因的组织特异性检测
• 3.10.2 差异基因的时序特异性检测
• 3.10.3 胚特异表达基因的荧光定量检测
• 4 讨论
• 4.1 脂肪酸代谢调控基因
• 4.2 蛋白质合成调控基因
• 4.3 糖类的合成降解调控基因
• 4.4 能量和物质贮藏转运调控基因
• 4.5 胁迫响应调控基因
• 4.6 发育调控相关基因
• 4.7 其它差异基因
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 下一步工作设想
• 作者简历
• 研究生在读期间发表文章