致鱼细菌性败血症嗜水气单胞菌特异性卵黄抗体的制备及性能研究

论文摘要

淡水鱼类细菌性败血症（Systemic Bacterial Septicemia）是目前我国水产养殖史上危害鱼的种类最多、流行水域最广、造成严重经济损失的一种急性传染病,已成为制约淡水鱼类养殖业健康发展的最主要疫病之一。常用的抗生素等化学药剂存在的许多弊端,使得寻找一种安全、高效的抗生素替代品成为一个亟待解决的问题。本研究以引起鱼类细菌性败血症的主要致病菌-嗜水气单胞菌（Aeromolla hydrophila, A. hydrophila）为抗原,免疫罗曼蛋鸡获得特异性IgY；IgY经分离、纯化后,测定其纯度、抗体效价以及特异性抗体的含量,并用体外抑菌,免疫荧光等实验对特异性IgY在体外对嗜水气单胞菌生长的抑制作用进行了研究；通过口服,浸泡和注射方式,考察特异性IgY对患细菌性败血症黑龙江银鲫的治疗和预防作用效果。研究结果表明,水稀释-盐析-凝胶过滤等方法提取纯化的特异性IgY纯度可达89.3%,水溶性组分（1：6稀释）中总IgY的含量为9.47 mg/mL,特异性IgY的含量随免疫时间的延长而显著增高,最高可达1.25mg/mL,占总IgY含量的13.19%；特异性IgY的效价最高可达1：12800。免疫荧光结果显示,特异性IgY与嗜水气单胞菌有较强的结合作用。体外抑菌实验结果显示75mg/ml特异性IgY,能显著抑制嗜水气单胞菌在液体培养基中的生长（P<0.05）。将特异性IgY与病原菌粗提液按1：1的比例混合,腹腔注射健康黑龙江银鲫的实验结果表明,与对照组相比特异性IgY组可降低感染鱼的累计死亡率40%左右。考察饲喂含不同比例特异性IgY的饲料对攻毒前后黑龙江银鲫的保护和治疗效果可见,添加5%特异性IgY的被动保护效果最佳,累计死亡率在50%左右；添加0.5%特异性IgY的治疗效果最差,累计死亡率为80%；考察用不同浓度的IgY水溶液浸泡黑龙江银鲫之后,用病原菌攻毒的保护效果和攻毒后用不同浓度的IgY水溶液浸泡鱼的治疗效果可见,浸泡于400mg/mL特异性IgY溶液的预防组效果最好,死亡率为30%；考察注射不同剂量的IgY后用病原菌攻毒的保护效果和攻毒后注射不同剂量IgY的治疗效果显示,注射4mg/尾特异性IgY的预防效果较好,死亡率为50%。在相同浓度剂量下,无论采用何种给药方式,预防效果都优于治疗效果。研究结果表明,制备的抗A.hydrophila特异性IgY对黑龙江银鲫的败血症具有一定的防治作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 鱼细菌性败血症的研究进展
• 1.1.1 主要病原菌及发病原因
• 1.1.2 致病菌的检测
• 1.1.3 流行病学研究进展
• 1.1.4 细菌性败血症的预防和治疗
• 1.2 IgY的研究进展
• 1.2.1 IgY的结构及功能
• 1.2.2 IgY的免疫学性质
• 1.2.3 IgY的分离与纯化
• 1.2.4 IgY的作用机理研究
• 1.2.5 IgY的应用
• 1.3 本论文的研究意义和主要工作
• 2 抗嗜水气单胞菌特异性IgY的制备和分离纯化
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料及设备
• 2.2.1 实验动物
• 2.2.2 菌种
• 2.2.3 试剂
• 2.2.4 仪器
• 2.2.5 溶液配置
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 细菌培养
• 2.3.2 嗜水气单胞菌灭活疫苗的制备
• 2.3.3 蛋鸡的免疫
• 2.3.4 鸡蛋的收集及水溶性组分的提取
• 2.3.5 免疫应答的考察
• 2.3.6 水溶性组分中总蛋白质含量的测定
• 2.3.7 特异性IgY抗体效价的检测
• 2.3.8 特异性IgY抗体的含量的测定
• 2.3.9 IgY分离、纯化的工艺路线
• 2.3.10 分离纯化各阶段IgY的变化
• 2.3.11 总IgY纯度和回收率的测定
• 2.3.12 统计学分析
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 最佳抗原包被量和抗体稀释倍数的确定
• 2.4.2 免疫后特异性IgY水平的变化情况
• 2.4.3 特异性IgY抗体效价的检测
• 2.4.4 WSF中总IgY含量及特异性IgY含量
• 2.4.5 层析法进一步纯化IgY
• 2.4.6 IgY的SDS-PAGE
• 2.4.7 IgY分离后纯度和回收率的测定
• 2.5 小结
• 3 特异性卵黄抗体的体外抑菌活性
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料及设备
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 试剂
• 3.2.3 仪器
• 3.2.4 溶液配置
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 免疫荧光
• 3.3.2 特异性IgY对抗原菌的生长抑制
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 免疫荧光
• 3.4.2 特异性IgY对病原菌的生长抑制
• 3.5 小结
• 4 动物体内攻毒预防与治疗实验
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料及设备
• 4.2.1 试剂
• 4.2.2 仪器
• 4.2.3 实验动物
• 4.2.4 病原菌
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 投喂饲料的制备
• 4.3.2 体外中和实验
• 4.3.3 口服实验
• 4.3.4 浸泡实验
• 4.3.5 注射实验
• 4.3.6 血液生理指标的检测
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 投喂饲料的制备
• 4.4.2 IgY对A.hydrophila的中和效果
• 4.4.3 口服防治效果
• 4.4.4 浸泡防治效果
• 4.4.5 注射防治效果
• 4.4.6 IgY对感染鱼生理指标的影响
• 4.5 讨论
• 4.6 小结
• 5 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 附录A 缩写词
• 致谢