论文摘要
本研究以白桦（Betulaplatyphylla）花药悬浮细胞系为材料,筛选出诱导三萜合成的最适硝普钠（SNP,NO供体）浓度。在此基础上,深入研究了 NO诱导过程中三萜含量、细胞活力、丙二醛（MDA）、脯氨酸以及抗氧化酶系（过氧化氢酶CAT、抗坏血酸过氧化物酶APX和过氧化物酶POD）的动态变化情况。通过添加碘二苯（DPI,NADPH氧化酶活性抑制剂）、二乙基二硫代氨基甲酸钠（DDTC,超氧化物歧化酶活性抑制剂）以及过氧化氢酶（CAT,H2O2清除剂）,综合分析了外源NO诱导过程中活性氧（ROS）含量的变化及其对三萜含量的影响,以此阐明NO与ROS信号互作在调控细胞生长和三萜合成中的作用。研究添加钙离子通道阻断剂和钙离子螯合剂情况下NO对三萜积累的影响,揭示钙信号在NO诱导三萜合成过程中的作用。此外,也分析了 NO诱导过程中细胞凋亡程度,揭示诱导凋亡和次生代谢物积累的关系。主要研究结果如下:1、外源NO对白桦三萜含量、细胞生长情况、抗氧化酶活性以及相关基因表达的影响0.0lmM,0.1 mM,1 mM,10 mM和20 mM SNP处理48h内,总三萜积累表现为促进作用,而对细胞鲜重的增长表现为抑制作用。48h总三萜含量依次比对照高19.43%、40.14%、43.20%、30.89%和 12.05%,细胞鲜重依次比对照降低 28.90%、42.68%、45.42%、71.96%和64.90%。SNP浓度低于1mM时总三萜含量与SNP浓度呈剂量依赖效应,选择1mMSNP为处理的最适浓度。1mMSNP处理12h细胞内齐墩果酸含量达到对照的5.69倍。据此提出NO促进白桦三萜合成技术为:白桦悬浮细胞培养周期为10天,在第8天加入SNP使其终浓度为1mmol/L,培养12h后收获,齐墩果酸含量最高,培养48h收获,细胞内总三萜含量最高。外源NO可在短期内（0～6h）激活防御系统启动,其中CAT和PAL活性分别升高73.03%和35.19%,APX和POD则在12h后启动,、平均活性分别升高106.94%和43.36%。外源NO对白桦细胞造成一定胁迫,0～168h细胞内MDA和脯氨酸的含量均高于对照,其平均含量分别比对照增加18.67%和38.34%。外源NO通过调节三萜代谢途径中的关键酶活性来调节白桦细胞内三萜含量。经lmmol/LSNP诱导,3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因（BpHMGR）、脱氧木酮糖磷酸还原异构酶基因（BpDXR）、角鲨烯环氧酶基因（BpSQS）、β-香树脂醇合酶基因（BpBPY）和细胞色素P450酶基因（BpCYP716A）分别在诱导后48h、24h、24h、6h和6h达到相对较高的表达水平,依次是对照的1.89倍、11.31倍、4.23倍、948.23倍和10.48倍。与此同时,外源NO诱导6h后钙调蛋白基因(BpCALALD表达水平达到对照的53.73倍、24h后硝酸还原酶基因（BpNIA）表达水平达到对照的29.65倍、12h后一氧化氮合酶基因（BpNOS）表达水平达到对照的2.10倍,对抗氧化酶基因Cu-Zn-SOD基因（BpSODC,3.39倍）以及血红素加氧酶基因（BpHO,4.43倍）的表达也有上调作用。2、外源NO通过活性氧途径诱导三萜物质合成外源NO诱导了白桦细胞ROS含量的升高,诱导6h后细胞内H202含量是对照的3.03倍,12h后超氧阴离子（O2-）含量是对照的1.64倍。DPI加SNP组和CAT加SNP组分别处理48h和12h后,齐墩果酸含量分别比SNP组低38.70%和46.68%,而DDTC加SNP组处理12h的齐墩果酸含量比SNP组高38.87%;清除H202导致BpDXR基因表达水平降低46.41%,而细胞内累积的O2C-可导致BpDXR基因表达水平升高322.81%,说明ROS参与外源NO对萜类代谢途径的调控。H202的清除导致BpCALM基因表达水平降低63.14%,ROS来源被部分抑制后BpNIA基因表达水平降低74.65%,揭示ROS介导了 NO诱导产生内源信号（Ca2+和NO）的过程。3、外源NO诱导三萜物质合成需钙信号参与外源NO可在6h内诱导白桦细胞内Ca2+含量的升高。胞内钙库和胞外钙环境的Ca2+共同参与了外源NO对白桦三萜合成过程的调控及对细胞生长的抑制,硝苯地平组和LiCl组处理12h,齐墩果酸含量分别比SNP组低68.84%和65.53%;处理48h细胞鲜重分别比SNP组高50.39%和40.35%。而硝苯地平组处理12h细胞活力比SNP组低41.41%,LiCl组与SNP组差异不显著,暗示Ca2+信号的下游反应可抑制NO引发的细胞活力的降低,胞外钙环境的影响似乎更大。Ca2+信号通路受阻抑制了白桦细胞抗氧化系统启动,其中CAT、APX、POD等抗氧化酶活性最多分别降低76.46%、17.96%和71.00%,Mn-SOD基因（BpSODM）表达水平降低53.99%,同时胞内ROS含量最大升高幅度为158.62%,揭示Ca2+信号通路的开关可通过改变抗氧化酶活性及其编码基因的表达来调控胞内ROS水平。Ca2+信号.通路受阻抑制外源NO对三萜合成关键酶基因的上调表达作用,硝苯地平组的BpBPY基因表达水平降低 59.67%,BAPTA/AM[1,2-bis（2-aminophenoxy）ethane-N,N,N,N’-tetraacetic acid]组BpHMGR基因降低54.94%,揭示Ca2+通过调控关键酶基因表达和酶活性来调控白桦细胞内三萜的合成过程。LiCl组BpDXR基因上调108.49%,BpHMGR基因则下调49.30%,揭示Ca2+信号对基因表达的调控可能存在多种模式。4,外源NO对细胞凋亡的影响外源NO在调控三萜合成的过程中也诱导了白桦细胞的凋亡,使细胞死亡率升高。NO诱导后48h细胞凋亡率为29.99%,为对照组的3.07倍,升高幅度最大。NO诱导后12h和48h,细胞死亡率提升幅度最大,分别为对照组的3.41倍和2.62倍。凋亡率变化趋势与白桦细胞内齐墩果酸含量变化趋势相似。ROS和Ca2+信号均参与外源NO对白桦细胞凋亡诱导作用,其中H2O2是介导细胞凋亡过程的主要ROS成分,O2-在诱导细胞死亡的过程中发挥重要作用。