蜱病原真菌的分离、鉴定及其生物学特性研究

论文摘要

蜱是寄生于动物体表的一类常见外寄生虫,同时又是多种疾病的传播媒介,是严重危害人畜健康,制约畜牧业发展的重要因素。传统化学药物防控方法随着蜱的耐药性产生和人们对环境安全的强调,越来越受到限制,蜱的免疫防治和利用天敌生物所开展的生物防治已成为该研究领域的研究热点。本研究以小亚璃眼蜱和微小牛蜱两种硬蜱为研究对象,从不同来源的虫生真菌菌株中筛选对蜱具有高致病性的菌株,并系统的研究它们对蜱的致病性、生物学特性、与常用植物杀虫剂溴氰菊酯的相容性及液固双相培养条件的优化等。针对目前用于蜱防治药物的药效持久期短的技术难点,旨在探索适合蜱生物防治的新途径,通过将植物杀虫剂与对蜱高致病性的虫生真菌联合应用,初步研制蜱的生物防治制剂,为蜱的综合防治提供新思路。主要研究结果如下:1.用选择性培养方法从不同生境来源的84份土壤样品和24份罹病僵虫中分离出虫生真菌29株,经过形态学及分子生物学方法进行了鉴定,其中:球孢白僵菌17株,金龟子绿僵菌11株,淡紫拟青霉1株。2.采用体外药物浸渍法,经过生物测定,从分离的13株虫生真菌中筛选出对小亚璃眼蜱饱血雌蜱致病性较高的球孢白僵菌3株,并用微小牛蜱饱血雌蜱进行复筛,发现球孢白僵菌B.bAT17对两种蜱均有较高致死作用。3.在菌药相容性试验中,观察了常用植物杀虫剂溴氰菊酯对球孢白僵菌B.bAT17菌株菌丝生长、孢子萌发的影响,结果表明,低浓度的溴氰菊酯与球孢白僵菌B.bAT17菌株具有较好兼容性,随着试验用药浓度的提高该菌株的菌丝生长和孢子的抑制作用加强。菌药协同试验证实,菌药混用的效果优于单独使用真菌制剂或溴氰菊酯,对蜱的致死率可达到100%。4.采用单因素筛选方案对球孢白僵菌B.bAT17菌株最适基础培养基、培养温度、pH值、碳源、氮源、微量元素及液固双相发酵配方进行研究,发现该菌株在PDA、PPDA、PDAY、SDAY、SMAY五种培养基上均能较好生长,在PDA上生长最快,在PDAY上产孢量最大。温度对菌丝的生长和产孢影响显著,25°C菌丝生长最快,且产孢量最大。球孢白僵菌B.bAT17菌株在pH 4?10范围内均可生长,在偏碱性环境内生长最快,在pH 5?6的偏酸性环境内产孢量最大。综合评价真菌各项指标后,葡萄糖和酵母粉为菌丝生长和产孢的最佳碳源和氮源,固体物料麦麸+玉米粉+米粉与基础培养液3/4 SDAY按2:1均匀混合后,添加0.05% K+可作为菌株固体发酵的最佳物料配方组合,为球孢白僵菌真菌制剂的规模化生产提供了实践和理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 第一篇 文献综述
• 1. 研究目的和意义
• 2. 虫生真菌资源概述
• 2.1 虫生真菌的发展历程
• 2.2 虫生真菌在蜱生物防控中的研究现状
• 2.3 虫生真菌对宿主的侵染机制
• 2.3.1 分生孢子在蜱体壁上的吸附和萌发
• 2.3.2 侵染结构的形成
• 2.3.3 穿透寄主体壁进入血腔
• 2.3.4 菌丝体在寄主体内生长或产生毒素，战胜昆虫的免疫系统致死昆虫
• 2.3.5 分生孢子形成与再侵染
• 2.4 虫生真菌侵染过程的相关酶及毒素
• 2.4.1 低分子毒素
• 2.4.2 高分子毒素
• 2.4.2.1 孢外蛋白酶
• 2.4.2.2 几丁质酶
• 2.4.2.3 酯酶和脂酶
• 2.4.2.4 其它酶类
• 2.5 虫生真菌与农药配伍的研究
• 2.6 虫生真菌的生产及应用现状
• 第二篇 研究报告
• 第一章 蜱病原真菌的分离和鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 土壤样品和罹病昆虫的采集
• 1.1.2 供试培养基制备
• 1.1.2.1 基础培养基制备
• 1.1.2.2 白僵菌选择性培养基制备
• 1.1.2.3 绿僵菌选择性培养基制备
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 稀释平板法
• 1.2.2 组织分离法
• 1.3 分离菌落的鉴定
• 1.3.1 分离菌落的形态学鉴定
• 1.3.2 分离菌株的分子生物学鉴定
• 1.3.2.1 引物设计
• 1.3.2.2 分离菌株基因组DNA 的提取
• 1.3.2.3 目的序列的扩增
• 1.3.2.4 目的序列PCR 产物的回收
• 1.3.2.5 PCR 产物与pGEM-T Easy 载体的连接反应
• 1.3.2.6 连接产物的转化
• 1.3.2.7 重组质粒的提取与鉴定
• 1.3.2.7.1 重组质粒的提取
• 1.3.2.7.2 PCR 扩增重组质粒的鉴定
• 1.3.2.8 目的片段的序列测定
• 2 结果
• 2.1 病原菌株的分离
• 2.2 分离菌株的鉴定
• 3 讨论
• 第二章 蜱病原真菌的致病力筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌株
• 1.2 供试蜱种
• 1.3 常用仪器
• 1.4 方法
• 1.4.1 孢子悬浮液的制备与浓度测定
• 1.4.2 分离菌株的初步筛选
• 1.4.3 利用不同蜱种对分离菌株进行复筛
• 1.4.4 优势菌株的毒力评价
• 1.4.5 数据统计分析
• 2 结果
• 2.1 分离菌株的初步筛选
• 2.2 利用不同蜱种对分离菌株进行复筛
• 2.2.1 球孢白僵菌B.bAT25 菌株对微小牛蜱的致病力测定
• 2.2.2 球孢白僵菌B.bAT01 菌株对微小牛蜱的致病力测定
• 2.2.3 球孢白僵菌B.bAT17 菌株对微小牛蜱的致病力测定
• 2.3 优势菌株的毒力评价
• 3 讨论
• 第三章 球孢白僵菌与溴氰菊酯的协同效应
• 1. 材料和方法
• 1.1 供试菌株及杀虫剂
• 1.2 供试蜱种
• 1.3 相容性测定
• 1.3.1 溴氰菊酯对球孢白僵菌孢子萌发的影响
• 1.3.2 溴氰菊酯剂对球孢白僵菌菌丝生长的影响
• 1.4 生物测定
• 1.5 数据处理
• 2 结果
• 3 讨论
• 第四章 蜱病原球孢白僵菌生物学特性的研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验菌株
• 1.1.2 基础培养基
• 1.1.3 液体培养基
• 1.1.4 固相培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 不同基础培养基对真菌生长和产孢的影响
• 1.2.2 不同温度对真菌生长和产孢的影响
• 1.2.3 不同pH 值对真菌生长和产孢的影响
• 1.2.4 不同碳源对真菌生长和产孢的影响
• 1.2.5 不同氮源对真菌生长和产孢的影响
• 1.2.6 不同微量元素对真菌生长和产孢的影响
• 1.2.7 不同固体配料物对真菌产孢的影响
• 1.2.8 不同液体培养基对真菌产孢的影响
• 1.2.9 最佳物料配方对真菌产孢的影响
• 1.2.10 最佳物料配方组合下孢子萌发率的测定
• 1.3 数据处理
• 2. 结果
• 2.1 不同培养基对真菌生长和产孢的影响
• 2.2 不同温度对真菌生长和产孢的影响
• 2.3 不同pH 值对真菌生长和产孢的影响
• 2.4 不同碳源对真菌生长和产孢的影响
• 2.5 不同氮源对真菌生长和产孢的影响
• 2.6 不同微量元素对真菌生长和产孢的影响
• 2.7 固体基础配方对真菌产孢的影响
• 2.8 液体基础配方对真菌产孢的影响
• 2.9 复合配方对真菌产孢的影响
• 2.10 原粉萌发率的测定
• 3 讨论
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 导师简介