桑树内生拮抗细菌Burkholderia cepacia Lu10-1的分离鉴定及其侵染定殖规律研究

论文摘要

桑树（Morus alba L.）在我国的栽培已有七千多年的历史,是蚕业生产的重要物质基础,也是传统的药用植物。但近年来桑树病害的发生表现出逐年上升的趋势,严重阻碍了蚕桑生产的可持续发展。现阶段对各种桑树病害的防治很大程度上依赖于化学农药的使用,由此带来的环境污染、农药残留等诸多问题引起人们广泛关注。因而,寻求对桑树病害合理有效的防治措施已势在必行。作为一类新型的生防因子,植物内生细菌是定殖在健康植物的各种组织和器官中,与植物之间形成互惠共存、相互制约的和谐联合关系的一类微生物。其不易受环境条件的影响,可在植物体内长期定殖和传导,更有利于发挥生防作用,已成为植物病害生物防治上一类极具应用潜能的资源菌。因此,从桑树体内分离筛选有益细菌应用于桑树病害的生物防治具有重要的现实意义,但目前尚未见有桑树内生细菌的相关研究报道。鉴于此,本研究对从健康桑树叶片中分离到的一株内生拮抗细菌Lu10-1进行了系统的分类学鉴定,并测定了该内生细菌在桑树体内的定殖数量消长动态,探讨了该菌株在桑树体内的侵染定殖规律。主要研究结果如下:1对桑树内生拮抗细菌Lu10-1进行了抑菌谱的测定。结果表明,菌株Lu10-1对9株供试植物病原真菌、2株革兰氏阴性及1株革兰氏阳性病原细菌均表现出较强的抗菌活性,抑菌谱较广;病原菌中包括桑炭疽病菌（Colletotrichum morifolium）、桑粘格孢菌（Septogloeum mori）、桑丁香假单孢杆菌（Pseudomonas syringae pv. mori）三株桑树主要病原菌。2对菌株Lu10-1进行了系统的分类学鉴定。结果表明,Lu10-1菌株归属于洋葱伯克霍尔德氏菌基因型Ⅰ（Burkholderia cepacia genomovarⅠ）,菌株的16S rDNA序列已在GenBank中注册,登录号为EF546394。3采用双抗药性标记法测定了Burkholderia cepacia Lu10-1在桑树体内的数量消长动态。结果表明,Lu10-1菌株可通过浸种、浸根、涂叶和针刺等接种方法进入桑树体内定殖,并证实了该内生细菌能够在桑树体内不同组织之间转移和传导。Lu10-1菌株浸种接种后,细菌在桑树体内的定殖数量总体上呈现下降趋势,到第20天后菌量趋于稳定;细菌浸根接种后,在根、茎和叶中定殖的菌量均呈现出“先增后降”的趋势。该菌株可在桑树体内长期定殖,且在定殖过程中菌株的拮抗性能未改变。4用扫描电子显微镜观察了Burkholderia cepacia Lu10-1对桑树根的吸附和侵染情况。结果表明,Lu10-1菌株在桑树根各区的吸附和分布存在较大差异,根成熟区根毛表面和伸长区为内生细菌Lu10-1在根表面吸附的优先位点。该菌可从主根与侧根的交联处、根毛分生处、根毛表面、外表皮裂痕以及根外表皮细胞的间隙等部位直接侵入到桑树根表皮内。5用gfp基因标记了Burkholderia cepacia Lu10-1。结果表明,标记细菌在481 nm的蓝光激发下发出明亮的绿色荧光,gfp基因在Lu10-1菌株中得到了很好的表达。且pGFP4412质粒在菌株Lu10-1中的遗传稳定性较强,可以满足在桑树体内实时监测的需要。6用激光共聚焦扫描显微镜实时监测了Burkholderia cepacia Lu10-1在桑树体内的侵染、转移、传导和定殖全过程。结果表明,该菌主要从主根与侧根交联处,根毛分生处和根毛进入桑树根的皮层和中柱,通过输导组织向桑树茎部、叶柄和叶片中迁移,主要定殖在桑树各维管组织和皮层的细胞间隙,细胞内未发现标记细菌的定殖。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 植物内生细菌的研究概况
• 1.1 植物内生细菌的定义
• 1.2 植物内生细菌的普遍存在性和生物多样性
• 1.3 植物和内生细菌的微生态系统
• 1.4 植物内生细菌的内生定殖研究概况
• 1.4.1 植物内生细菌的来源
• 1.4.2 植物内生细菌的侵染定殖过程研究
• 1.4.3 植物内生细菌定殖影响因子研究
• 1.4.3.1 内生细菌的性状
• 1.4.3.2 寄主植物品种及类型
• 1.4.3.3 相关微生物
• 1.4.3.4 植物寄生线虫
• 1.4.4 植物内生细菌定殖检测方法研究
• 1.4.4.1 抗生素标记法
• 1.4.4.2 免疫学方法
• 1.4.4.3 基因标记法
• 1.4.4.4 特异性寡核苷酸片段标记法
• 1.5 植物内生细菌作为生防因子的研究进展
• 1.5.1 植物内生细菌作为生防因子的优点
• 1.5.1.1 内生细菌占据有利于生防的生态位
• 1.5.1.2 内生细菌可与病菌直接相互作用
• 1.5.1.3 内生细菌可作为外源基因的载体
• 1.5.2 内生细菌的防病机制
• 1.5.2.1 分泌抗菌活性物质
• 1.5.2.2 营养和生态位的竞争
• 1.5.2.3 增强宿主植物的抗逆性
• 1.5.2.4 诱导植物系统抗性
• 1.6 植物内生细菌的开发与应用前景
• 1.6.1 内生生物菌剂的应用
• 1.6.2 植物内生工程细菌的构建
• 1.6.3 其他方面
• 1.7 植物内生细菌研究中存在的问题
• 2 洋葱伯克霍尔德氏菌的研究概况
• 2.1 洋葱伯克霍尔德氏菌概述
• 2.1.1 洋葱伯克霍尔德氏菌的分类地位研究
• 2.1.2 洋葱伯克霍尔德氏菌的分离鉴定
• 2.2 洋葱伯克霍尔德氏菌作为生防菌的应用
• 3 绿色荧光蛋白作为分子标记物在微生物学中的应用研究进展
• 3.1 绿色荧光蛋白
• 3.2 新型报告基因—绿色荧光蛋白基因
• 3.3 gfp 基因标记微生物的检测方法
• 3.4 gfp 基因在植物与微生物之间互作研究中的应用
• 4 本研究的目的及意义
• 第一章 桑树内生拮抗细菌Burkholderia cepacia Lu10-1 的分离鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试植物材料
• 1.1.2 供试病原菌
• 1.1.3 培养基及缓冲液
• 1.1.4 主要试剂
• 1.1.5 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 桑树内生细菌分离
• 1.2.2 内生拮抗菌株的筛选及Lu10-1 菌株抑菌谱的测定
• 1.2.3 菌株鉴定
• 1.2.3.1 菌株培养特征和菌体形态观察
• 1.2.3.1.1 菌株培养特征观察
• 1.2.3.1.2 菌体形态观察
• 1.2.3.2 生理生化指标测定
• 1.2.3.3 16S rRNA 基因序列测定及其系统进化树的构建
• 1.2.3.3.1 细菌基因组DNA 的提取
• 1.2.3.3.2 16S rRNA基因的PCR扩增及序列分析
• 1.2.3.4 recA 基因特异引物PCR 检测法鉴定Lu10-1 菌株的基因型
• 2 结果与分析
• 2.1 不同品种桑树内生细菌的数量测定结果
• 2.2 内生拮抗菌株的筛选及Lu10-1 菌株抑菌谱的测定
• 2.3 Lu10-1菌株的菌体形态及菌落特征
• 2.4 Lu10-1菌株的生理生化特征
• 2.5 16S rRNA基因序列测定及其系统发育树的构建
• 2.6 Lu10-1菌株的基因型鉴定
• 3 讨论
• 3.1 关于桑树内生细菌的分离
• 3.2 关于桑树内生拮抗细菌 Lu10-1 的筛选
• 3.3 关于桑树内生拮抗细菌 Lu10-1 的鉴定
• 3.4 关于进一步研究的设想
• 第二章 桑树内生拮抗细菌Burkholderia cepacia Lu10-1 的侵染定殖规律研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株与质粒
• 1.1.2 供试植物材料
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 主要试剂
• 1.1.5 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 内生细菌Lu10-1 在桑树体内的数量消长动态测定
• 1.2.1.1 内生细菌双抗药性突变菌株的筛选
• 1.2.1.2 双抗药性突变菌株Lu10-1R 桑树体内定殖测定接种方法
• 1.2.1.3 双抗药性突变菌株Lu10-1R 的回收与计数
• 1.2.1.4 回收菌株Lu10-1P 的鉴定及拮抗作用测定
• 1.2.2 内生细菌Lu10-1 侵染桑树根的扫描电镜观察
• 1.2.2.1 桑树种子消毒及菌液制备
• 1.2.2.2 桑树幼苗接菌与培养
• 1.2.2.3 取样及扫描电子显微镜（SEM） 观察
• 1.2.2.3.1 取样
• 1.2.2.3.2 扫描电镜样品制作方法
• 1.2.3 gfp 基因标记法检测内生细菌 Lu10-1 对桑树的侵染与定殖
• 1.2.3.1 内生细菌Lu10-1的gfp基因标记
• 1.2.3.1.1 pGFP4412 质粒的提取
• 1.2.3.1.2 菌株Lu10-1 感受态细胞的制备
• 1.2.3.1.3 质粒pGFP4412转化菌株Lu10-1感受态细胞
• 1.2.3.1.4 转化子的筛选
• 1.2.3.1.5 转化子的鉴定
• 1.2.3.1.6 转化菌株质粒遗传稳定性测定
• 1.2.3.2 桑树幼苗的培养和接种
• 1.2.3.3 用激光共聚焦扫描显微镜 （CLSM） 监测 gfp 基因标记菌
• 2 结果与分析
• 2.1 内生细菌Lu10-1 在桑树体内的数量消长动态测定结果
• 2.1.1 双抗药性突变菌株Lu10-1R 的筛选
• 2.1.2 不同方法接种双抗标记菌株Lu10-1R 在桑树体内的定殖测定
• 2.1.3 浸种接种检测菌株在桑树体内的消长动态
• 2.1.4 浸根接种检测菌株在桑树体内的消长动态
• 2.1.5 回收菌株常规鉴定及拮抗作用测定
• 2.2 内生细菌Lu10-1 侵染桑树根的 SEM 观察
• 2.2.1 内生细菌 Lu10-1 在桑树幼根表面的吸附和分布观察
• 2.2.2 内生细菌Lu10-1 侵入桑树根的途径观察
• 2.3 gfp 基因标记法检测内生细菌 Lu10-1 对桑树的侵染与定殖
• 2.3.1 内生细菌Lu10-1的gfp基因标记
• 2.3.2 用CLSM监测gfp基因标记菌株Lu10-1对桑树的侵染和定殖
• 2.3.2.1 gfp 基因标记菌株Lu10-1 对桑树根的侵染与定殖
• 2.3.2.2 gfp 基因标记菌株从桑树根部向茎、叶部的迁移
• 2.3.2.3 gfp 基因标记菌株在桑树中的稳定定殖
• 3 讨论
• 3.1 关于内生细菌 Lu10-1 在桑树体内的数量消长动态
• 3.2 关于内生细菌 Lu10-1 在桑树根表面的吸附和分布规律
• 3.3 关于内生细菌 Lu10-1 侵入桑树根的途径
• 3.4 关于内生细菌 Lu10-1 的 gfp 基因标记
• 3.5 关于内生细菌 Lu10-1 对桑树的侵染和定殖
• 3.6 关于进一步研究的设想
• 结论
• 参考文献
• 图版
• 致谢
• 硕士研究生期间发表的论文