mrfA介导的红曲菌形态发育与代谢调控的研究

论文摘要

红曲菌（Monascus spp.）是红曲的生产菌种,红曲被广泛地用做食品添加剂、中药配伍与发酵剂等,在亚洲已有上千年的应用历史。近年来,红曲菌多种活性代谢产物如Monacolin K、γ-氨基丁酸、色素和抗氧化剂成分（Dimerumic acid）等的分离和鉴定令红曲菌代谢产物的生物合成途径备受关注。研究表明,真菌次生代谢产物的生物合成不仅与结构基因密不可分,同时受调节基因的严格调控,因此对红曲菌调节基因的研究有助于深入阐释其次生代谢的分子调控机制。G-蛋白信号调节子（Regulators of G-protein signaling, RGSs）是一类与激活的GTP-Gα相互作用,从而调节G-蛋白信号强度和持续时间的蛋白质。对多种丝状真菌G-蛋白信号调节子的功能研究表明,它们在调控营养生长、孢子形成、真菌毒素/色素合成以及致病性等生长发育及次生代谢过程中起到重要的作用。本课题组前期分离到了红曲菌的G-蛋白信号调节子的编码基因mrfA,氨基酸序列比对结果显示它与构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）中G-蛋白信号调节子flbA序列的同源性分别为88%和87%。在此基础上,本课题构建了ΔmrfA突变株；分析了突变株的形态发育与色素和橘霉素产生能力；比较了ΔmrfA突变株发酵过程中部分水解酶和抗氧化酶活性的变化；并探讨了mrfA基因对Gα亚基编码基因（mga1）、色素基因（pksP）、橘霉素合成基因（pksCT）、橘霉素转录调节基因（ctnA）以及几丁质酶合成基因（Chs）表达的调控作用。具体研究结果如下：1ΔmrfA突变株的构建以pCAMBIA33OO为载体,构建了mrfA基因的敲除载体pCMRFA,并通过农杆菌介导转化法（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT）将其导入到红曲菌M-7中,获得了153株转化子,通过PCR验证和Southern blot分析筛选了3株ΔmrfA突变株作为后续研究材料。2ΔmrfA突变株形态发育及色素与橘霉素产生能力的分析从菌落的生长速率与形态、显微形态、孢子数目与萌发速率、色素和橘霉素的产生能力等方面对红曲菌M-7和ΔmrfA突变株进行了比较。结果表明,与M-7相比,ΔmrfA突变株在PDA培养基上的生长速率慢,且差异显著（p<0.05）,菌落颜色浅,气生菌丝密集,在生长后期（第7d开始）菌落中心菌丝开始出现自溶；在显微镜下,未观察到ΔmrfA突变株的典型闭囊壳,不产生子囊孢子,但分生孢子数目为红曲菌M-7的4.7倍；在PDB液体培养基中于28℃静置培养,Δmr/A突变株孢子于第3h开始萌发,至12 h萌发完全,比红曲菌M-7滞后3h；在PDB液体培养基中于28℃,120r/min培养,第10d时,ΔmrfA突变株于390 nm和520 nm处色素产量分别为0.92±0.04 U/mL和0.51+0.02U/mL,而红曲菌M-7分别为4.42±0.16 U/mL和4.28±0.17 U/mL；ΔmrfA突变株的发酵液中仍未检出橘霉素,而红曲菌M-7橘霉素含量为1217.78±120.62ng/mL。由上述测定结果推测,红曲菌mrfA在菌落生长、有性繁殖、孢子萌发、色素和橘霉素产生等方面具有多样性的调节作用。3 AmrfA突变株在发酵过程中水解酶和抗氧化酶活性的变化对ΔmrfA突变株和红曲菌M-7在液态发酵过程中的生理变化进行了研究。结果发现,mrfA基因的敲除导致了在自溶初期（第7d以后）生物量的明显下降；生长期（第2-5 d）碳源利用速率的增加；蛋白酶活力、几丁质酶活力、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活力始终高于红曲菌M-7。其中蛋白酶活力在第7d时最大,ΔmrfA突变株为2.94 U/mL,而红曲菌M-7为1.04 U/mL；几丁质酶活在第8d时最大,ΔmrfA突变株为0.46 U/mL,而红曲菌M-7为0.36 U/mL；过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活力一直增加,到第10d时,ΔmrfA突变株的两种酶活分别为13.89U/mgprot和483.12 U/mgprot,而红曲菌M-7分别为5.40 U/mgprot和268.30 U/mgprot,推测这一现象与mrfA基因敲除促进了红曲菌自溶有关。4红曲菌mrfA对生长发育及代谢相关基因的转录调控利用RACE技术成功获得了mga1和mrfA全长cDNA序列,其中mga1的编码区序列长为1062 bp,编码353个氨基酸；而mrfA的编码区序列长为2205 bp,编码734个氨基酸。利用Real-time RT-PCR技术对mrfA基因和mga1基因间的调节作用进行研究,结果表明mrfA基因的缺失对Ga亚基的表达在第2 d时起上调作用而在第4、7和9 d时起下调作用；而mga1基因的缺失对mrfA基因的表达于第2、4、7和9 d时起下调作用。此外,mrfA基因对ctnA、pksCT、pksP及Chs基因的表达也具有调控作用,mrfA基因的缺失导致这4种基因的表达下调。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 红曲菌概述
• 2 G-蛋白信号调节子的研究
• 2.1 G-蛋白信号调节子的结构
• 2.2 G-蛋白信号调节子的调节机制
• 2.3 真菌中的G-蛋白信号调节子
• 2.3.1 FlbA
• 2.3.2 RgsA
• 2.3.3 RgsB、RgsC、RgsD和GprK
• 2.4 真菌中FlbA同源蛋白质的功能研究
• 2.4.1 对菌丝发育的调控
• 2.4.2 对有性与无性繁殖的调控
• 2.4.3 对次生代谢产物的调控
• 2.4.4 对致病力和应激反应的调控
• 3 真菌的自溶
• 3.1 自溶过程中形态的变化
• 3.2 自溶过程中几种水解酶
• 3.2.1 蛋白酶
• 3.2.2 葡聚糖酶
• 3.2.3 几丁质酶
• 3.3 自溶与氧化应激
• 3.3.1 活性氧物质的形成
• 3.3.2 主要的抗氧化剂及其生理功能
• 3.4 自溶的分子生物学研究
• 4 本研究的目的与意义
• 第二章 ΔmrfA突变株的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株与质粒
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 实验试剂的配制
• 1.1.4 培养基
• 1.1.5 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 敲除载体的构建
• 1.2.2 敲除载体转化根癌农杆菌的活化与筛选
• 1.2.3 根癌农杆菌介导的红曲菌转化
• 1.2.4 ΔmrfA突变株的验证
• 2 结果与分析
• 2.1 敲除盒的构建
• 2.2 敲除载体的构建与鉴定
• 2.3 含敲除载体的根癌农杆菌EHA105的鉴定
• 2.4 红色红曲菌M-7 mrfA基因缺失突变株的PCR验证
• 2.5 红色红曲菌M-7 mrfA基因缺失突变株的Southern blot分析
• 3 小结与讨论
• 3.1 小结
• 3.2 讨论
• 3.2.1 基因敲除载体的构建
• 3.2.2 根癌农杆菌介导的红曲菌转化
• 第三章 ΔmrfA突变株形态发育及色素与桔霉素产生能力的分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 红色红曲菌mrfA对生长发育的影响
• 1.2.2 红色红曲菌mrfA对色素和橘霉素合成的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 红色红曲菌mrfA对生长发育的影响
• 2.1.1 菌落形态观察
• 2.1.2 菌落显微形态观察
• 2.1.3 菌落生长速率的比较
• 2.1.4 孢子数目的比较
• 2.1.5 分生孢子萌发速率的比较
• 2.2 红色红曲菌mrfA对色素和橘霉素合成的影响
• 2.2.1 发酵液红曲色素的分析
• 2.2.2 发酵液橘霉素的分析
• 3 小结与讨论
• 3.1 小结
• 3.2 讨论
• 3.2.1 红色红曲菌mrfA对分生孢子的调控
• 3.2.2 红色红曲菌mrfA对橘霉素和色素合成的调控
• 第四章 ΔmrfA突变株在发酵过程中水解酶和抗氧化酶活性的变化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 实验试剂的配制
• 1.1.4 培养基
• 1.1.5 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 红曲菌液态发酵生物量的测定
• 1.2.2 红曲菌液态发酵残糖量的测定
• 1.2.3 红曲菌液态发酵蛋白酶活力的测定
• 1.2.4 红曲菌液态发酵pH的测定
• 1.2.5 红曲菌液态发酵几丁质酶活力的测定
• 1.2.6 红曲菌液态发酵CAT酶活力的测定
• 1.2.7 红曲菌液态发酵SOD酶活力测定
• 1.2.8 红曲菌液态发酵菌体蛋白质含量的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 红曲菌液态发酵生物量的测定
• 2.2 红曲菌液态发酵残糖量的测定
• 2.2.1 葡萄糖标准曲线
• 2.2.2 红曲菌液态发酵残糖的含量
• 2.3 红曲菌液态发酵蛋白酶活力的测定
• 2.3.1 酪氨酸标准曲线
• 2.3.2 红曲菌液态发酵蛋白酶活力
• 2.4 发酵液pH的测定
• 2.5 红曲菌液态发酵几丁质酶活力的测定
• 2.5.1 N-乙酰-D-氨基葡萄糖标准曲线
• 2.5.2 红曲菌液态发酵几丁质酶活力
• 2.6 红曲菌液态发酵CAT酶活力的测定
• 2.7 红曲菌液态发酵SOD酶活力的测定
• 3 小结与讨论
• 3.1 小结
• 3.2 讨论
• 3.2.1 MrfA缺失对于红曲菌自溶的影响
• 第五章 红曲菌mrfA对生长发育及代谢相关基因的转录调控
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 红色红曲菌RNA的提取
• 1.2.2 RNA质量的检测
• 1.2.3 红曲菌mrfA基因和mga1基因cDNA全长的克隆
• 1.2.4 cDNA片段的拼接及序列分析
• 1.2.5 mrfA基因与mga1基因间的调节作用
• 1.2.6 mrfA基因对ctnA、pksCT、pksP及Chs在转录水平的调控作用
• 1.2.7 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 红曲菌总RNA的提取与纯度检测
• 2.2 mrfA基因和mga1基因的3’RACE和5’RACE扩增
• 2.3 mrfA基因和mga1基因cDNA全长的拼接及序列分析
• 2.4 mrfA基因与mga1基因间的调节作用
• 2.5 mrfA基因对ctnA、pksCT、pksP及Chs在转录水平的调控作用
• 3 小结与讨论
• 3.1 小结
• 3.2 讨论
• 3.2.1 MrfA与Ga亚基Mga1在转录水平的调控作用
• 3.2.2 MrfA对色素、橘霉素合成相关基因表达的调控
• 第六章 结论与展望
• 1 结论
• 2 展望
• 3 论文创新点
• 参考文献
• 致谢