植物病原拮抗细菌的发酵条件作用机制及定殖规律的研究

论文题目: 植物病原拮抗细菌的发酵条件作用机制及定殖规律的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物病理学

作者: 张昕

导师: 张炳欣

关键词: 拮抗,鉴定,发酵条件,基因,定殖,生态效应,评估,农药降解菌,多功能菌群

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 用稀释分离法从杭州近郊大棚蔬菜地根围土壤中共获得细菌菌株409枚,通过继代平皿对峙实验筛选出对Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum和Fusarium graminirum等多种植物病原菌有稳定拮抗作用的菌株ZJY-1、ZJY-13和ZJY-116。催芽实验和室内盆栽测定结果表明除ZJY-13外其余2个菌株均不会抑制种子的萌发且都具有明显的防病效果。引入田间小区后2个生防菌能有效防治黄瓜枯萎病和大麦赤霉病,显著降低病害的发生程度。此外,菌株ZJY-116有明显的促生作用,经ZJY-116种子处理的黄瓜种子播种后出苗早,幼根长而粗壮,子叶肥厚,黄瓜的平均单株产量以及果实均重都较健康对照高。根据常规的形态学观察、生理生化测定和16Sr DNA序列的同源性分析,生防菌株ZJY-1和ZJY-116分别被鉴定为短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）及枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。基因库中两菌株的登陆号分别为AY897210和AY897211。摇瓶发酵实验结果表明玉米粉和麸皮是菌株ZJY-1和ZJY-116筛选所得的最佳碳源和氮源,且当玉米粉为30g L-1、浮皮为10g L-1时菌株的生物量达到最大。最适合ZJY-1发酵的优化条件为:温度30℃、pH 7左右、供氧充足;最适ZJY-116发酵的优化条件为:温度32℃、pH 7-7.5、氧气对发酵的影响不大。菌株ZJY-1主要通过产生能够抑制菌丝正常生长以及分生孢子萌发的抗菌代谢产物达到抑制病原菌的目的。最适合抗菌代谢物质产生的碳源为葡萄糖,氮源为明胶,向培养液中添加0.2%甘露醇可大大促进该物质的产生。为研究两株拮抗细菌的定殖规律,将具有GFP荧光和氯霉素抗性的重组质粒pRP22-GFP,采用原生质体高频转化法,成功地导入生防菌Brevibacilluts brevis ZJY-1和Bacillus subtilis ZJY-116中,得到荧光标记菌株ZJY-1G和ZJY-116G。用这些标记菌株处理黄瓜种子及喷雾大麦穗部,通过平板稀释分离定期回收转化子,研究了GFP标记菌株在黄瓜根围和田间大麦穗部的定殖规律。结果表明,不论是在室内岔栽还是田间小区条件下,在黄瓜整个生育期两株生防菌株均能在根围稳定有效地定殖,并随着黄瓜盛花期和盛果期出现

论文目录:

摘要

Abstract

第一章文献综述

1.生物防治的研究现状

2.植物土传病害的生物防治

3.植物病害生物防治的作用机理

4.生防菌株的定殖研究

5.生防菌株的遗传改良

6.微生物投放到环境中的安全性评估

第二章拮抗细菌的分离筛选

1.材料

2.方法

2.1 拮抗细菌的分离、筛选

2.1.1 细菌的分离

2.1.2 病原菌的培养

2.1.3 拮抗细菌的筛选

2.2 拮抗菌的室内催芽和盆栽效果测定

2.2.1 拮抗菌的室内催芽

2.2.2 盆栽效果测定

2.3 田间小区试验

2.3.1 拮抗菌防治黄瓜枯萎病

2.3.2 拮抗菌防治大麦赤霉病

3.结果

3.1 拮抗细菌的分离和筛选

3.2 拮抗菌的室内催芽和盆栽效果测定

3.2.1 催芽实验

3.2.2 盆栽效果

3.3 田间小区试验

3.3.1 拮抗细菌在田间防治黄瓜枯萎病

3.3.2 拮抗细菌在田间防治大麦赤霉病菌

4.结论与讨论

第三章拮抗细菌的鉴定

1.材料

1.1 菌种与试剂

1.2 引物合成

2.方法

2.1 常规的革兰氏染色、菌体形态、菌落形状观察

2.2 生理生化反应

2.3 菌株的分子鉴定

2.3.1 菌株基因组DNA的提取

2.3.2 菌株基因组的16S rDNA序列扩增

2.3.3 PCR产物的纯化与回收

2.3.4 克隆与筛选

3.结果

3.1 菌株的形态特征

3.2 拮抗曲株的生理生化反应

3.3 菌株的分子鉴定结果

3.3.1 16S rDNA序列扩增及阳性克隆的鉴定

3.3.2 16S rDNA序列测定及分析

4.结论与讨论

第四章菌株发酵条件及作用机制的研究

1.材料

2.方法

2.1 菌株发酵条件的研究

2.1.1 种子液的制各

2.1.2 菌株最佳碳源的筛选

2.1.3 菌株最佳氮源的筛选

2.1.4 菌株的最佳碳氮比

2.1.5 拮抗细菌生长的最佳PH值

2.1.6 最佳发酵温度的测定

2.1.7 供氧量对细菌发酵的影响

2.1.8 菌株的生长曲线

2.2 菌株的拮抗机制研究

2.2.1 代谢产物对病原菌的抗菌作用测定

2.2.2 菌体对病原菌的抗菌作用测定

2.2.3 菌株生长曲线与代谢产物形成的关系

2.2.4 代谢产物盐析最佳饱和度的确定

2.2.5 拮抗粗提液的制备

2.2.6 拮抗粗提液对病原菌孢子萌发的影响

2.2.7 拮抗粗提液对菌丝生长的影响

2.2.8 抗菌粗提液稳定性的测定

2.3 代谢产物产生的条件优化

2.3.1 主要营养物质对菌株抗菌代谢产物产生的影响

2.3.2 其它金属离子及有机物质添加物对代谢产物产生的影响

3.结果

3.1 菌株发酵条件的研究

3.1.1 菌株发酵最佳碳源的筛选

3.1.2 菌株发酵最佳氮源的筛选

3.1.3 菌株的最佳碳氮比

3.1.4 初始PH值对菌株发酵的影响

3.1.5 最佳发酵温度的测定

3.1.6 供氧量对细菌发酵的影响

3.1.7 菌株的生长曲线

3.2 菌株的拮抗机制研究

3.2.1 菌株ZJY-1的拮抗机制研究

3.3 抗菌代谢产物产生的条件优化

3.3.1 主要营养物质对菌株抗菌代谢产物产生的影响

3.3.2 其它金属离子及有机物质添加物对代谢产物产生的影响

4.结论与讨论

第五章拮抗细菌的定殖规律研究

1.材料

2.方法

2.1 带有GFP基因的质粒向受体菌的转化

2.2 标记菌株代时及外源质粒稳定性的测定

2.3 GFP标记菌株在黄瓜根围的定殖研究

2.3.1 盆栽试验

2.3.2 田间小区测定

2.4 GFP标记菌株在田间大麦穗部的定殖研究

2.4.1 F.g接种物、拮抗细菌悬液的准备

2.4.2 实验设计

2.4.3 菌株的回收

3.结果

3.1 质粒pRP22-GFP向生防菌ZJY-1和ZJY-116的转化

3.2 转化菌株中质粒稳定性的测定

3.3 盆栽条件下菌株在黄瓜根围的定殖动态规律

3.3.1 菌株ZJY-1G在黄瓜根围的定殖

3.3.2 菌株ZJY-116G于黄瓜根围的定殖

3.3.3 盆栽条件下菌株在第二季植物根围富集的研究

3.3.4 二季植株死亡后标记菌株在土壤中存活情况

3.4 田间小区情况下菌株ZJY-1G和ZJY-116G在黄瓜根围的定殖

3.5 标记菌株在田间大麦穗部的定殖

3.5.1 ZJY-1G在大麦穗部的定殖

3.5.2 ZJY-116G在大麦穗部的定殖

4.结论与讨论

第六章生防菌株对根围其它微生物的影响

1.材料

2.方法

2.1 盆栽用土壤的准备

2.2 盆栽实验设计

2.3 引入环境拮抗细菌的生态效应

2.3.1 对土壤中可培养主要微生物种群数量的影响

2.3.2 引入环境的拮抗细菌对土壤酶活性的影响

2.3.3 土壤微生物群落结构的DGGE指纹图谱分析

3.结果

3.1 拮抗细菌对其它主要微生物种群数量的影响

3.2 引入环境的拮抗细菌对土壤酶活性的影响

3.2.1 对土壤脱氢酶活性的影响

3.2.2 对土壤脲酶活性的影响

3.2.3 对土壤过氧化氢酶活性的影响

3.2.4 对土壤蔗糖酶活性的影响

3.3 DGGE指纹图谱分析

3.3.1 土壤总DNA的提取

3.3.2 土壤DNA中16S rDNA片段的扩增

3.3.3 不同样本间土壤16Sr DNA片段的DGGE指纹图谱分析

4.结论与讨论

第七章多功能菌群混合施用的生态效应

1.材料

2.方法

2.1 毒死蜱降解菌的降解能力测定

2.2 供试菌株室内相容性实验

2.3 菌株在田间小区的表现特性

2.3.1 曲悬液的制备及黄瓜种子的处理

2.3.2 田间农药的准备

2.3.3 田间小区试验设计

2.3.4 供试菌株防病促生效应观察及土壤残留毒死蜱的检测

3.结果

3.1 毒死蜱降解菌的降解能力

3.2 供试菌株室内相容性实验结果

3.3 田间小区条件下生防菌与农药降解菌混用的多功能菌群的生态效应

3.3.1 菌株对黄瓜的防病促生作用

3.3.2 不同组合处理后的毒死蜱降解情况

4.结论与讨论

参考文献

附录：本实验涉及的图片说明、培养基及试剂

发布时间: 2005-07-22

参考文献

[1].番茄枯萎病和梨轮纹病生防菌控病机制研究及几丁质酶基因的克隆与表达[D]. 刘邮洲.南京农业大学2011
[2].苦参内生拮抗细菌筛选及其抗菌物质纯化鉴定[D]. 王芳.沈阳农业大学2009
[3].稻田养鸭抑制水稻纹枯病机制及拮抗细菌A168筛选鉴定研究[D]. 张亚.湖南农业大学2010

植物病原拮抗细菌的发酵条件作用机制及定殖规律的研究

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