杆状病毒介导O型口蹄疫病毒P12A和3C基因在Sf9细胞和BHK细胞中的共表达

论文摘要

口蹄疫（Foot-and-mouth disease FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus FMDV）引起偶蹄动物的烈性传染病,在世界各地均有流行,给各国畜牧业带来严重损失。虽然传统疫苗在该病的防控中起了重要的作用,但存在成本高、散毒等缺点,因此,研发一种新型高效的疫苗对于FMD的防控至关重要。空衣壳具有与完整病毒粒子相似的免疫原性,从而备受研究者的关注。本试验以O型FMDV衣壳蛋白前体P12A和蛋白酶3C为研究对象,成功构建了分别在Sf9细胞和BHK细胞中表达空衣壳蛋白的重组杆状病毒,为口蹄疫空衣壳疫苗及活载体疫苗的进一步研制奠定了基础。1.通过PCR的方法得到编码O型FMDV衣壳蛋白前体P12A的基因和编码蛋白酶3C的基因,将P12A和3C基因片段分别插入到杆状病毒载体pFastBacTMDual的PH启动子和P10启动子之下,构建了同时包含P12A和3C的重组杆状病毒BV-P12A-3C。感染Sf9细胞后通过间接免疫荧光、双抗体夹心ELISA检测目的基因的表达。间接免疫荧光检测结果显示,在Sf9细胞中观察到绿色荧光,表明目的基因获得了表达。双抗体夹心ELISA方法检测结果显示表达的蛋白能被O型FMDV阳性血清识别,具有一定的反应原性,但表达量较低,这一结果为O型FMD空衣壳疫苗的研究奠定了基础。2.通过基因合成的方法,将水泡性口炎病毒外功能区序列（VSV·GED）、poly A序列及CMV启动子的序列串联合成,命名为VSV·GED-CMV。将VSV·GED-CMV插入到杆状病毒载体pFastBacTMDual的PH启动子之下,将PCR扩增得到的O型FMDV P12A基因和3C基因串联后插入到VSV·GED-CMV序列之后,感染Sf9细胞后获得了包含P12A基因和3C基因的重组杆状病毒BV-VSV·GED-P12A-3C。用重组杆状病毒感染BHK细胞,48 h后进行间接免疫荧光检测。同时,收集被感染的BHK细胞裂解液进行双抗体夹心ELISA和Western blotting检测。间接免疫荧光检测结果显示,经重组杆状病毒BV-VSV·GED-P12A-3C感染的BHK细胞中观察到绿色荧光,表明目的基因获得了表达。双抗体夹心ELISA检测结果显示,被感染的BHK细胞裂解液能被O型FMDV阳性血清识别,但目的蛋白表达最高OD值约为阳性对照最高OD值的1/4。Western blotting检测结果显示,在25 Kda处有一条VP3/VP1的带,表明蛋白酶3C成功裂解衣壳蛋白前体P12A。然而,目的基因P12A-3C能否在哺乳动物活体内成功表达并自我组装成空衣壳还有待于进一步研究,这一结果为研究FMD活载体疫苗提供了前期资料。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 研究背景
• 1.1 口蹄疫病毒的分子生物学研究进展
• 1.1.1 FMDV 基因组的基本结构
• 1.1.2 FMDV 基因组非翻译区（Untranslated region，UTR）结构及功能
• 1.1.3 FMDV 基因组翻译区结构及功能
• 1.2 口蹄疫病毒基因工程疫苗研究进展
• 1.2.1 亚单位疫苗
• 1.2.2 活载体疫苗
• 1.2.3 基因缺失疫苗
• 1.2.4 可饲疫苗
• 1.3 杆状病毒表达载体研究进展
• 1.3.1 杆状病毒的生物学特性
• 1.3.2 杆状病毒表达载体的特点
• 1.3.3 Bac-to-Bac 的原理与优点
• 1.3.4 杆状病毒表达载体的应用
• 1.3.5 影响杆状病毒表达系统效率因素
• 1.3.6 杆状病毒与哺乳动物细胞
• 1.4 研究的目的意义
• 试验研究
• 第二章 O 型口蹄疫病毒P12A 和3C 基因在SF9 细胞中的共表达
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 口蹄疫病毒毒株
• 2.1.2 菌株、载体及细胞系
• 2.1.3 口蹄疫标准抗原及抗血清
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 目的基因P12A 和3C 的克隆
• 2.2.2 重组转移载体pD-P12A 3C 的构建
• 2.2.3 重组杆粒（Bacmid）的获得
• 2.2.4 重组杆状病毒的获得
• 2.2.5 目的蛋白的表达与检测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 目的基因P12A 和3C 的克隆
• 2.3.2 重组转移载体pD-P12A-3C 的构建
• 2.3.3 重组杆粒的获得
• 2.3.4 重组病毒的获得
• 2.3.5 目的蛋白的表达与检测
• 2.4 讨论
• 第三章 O 型口蹄疫病毒P12A 和3C 基因在BHK 细胞中的共表达
• 3.1 试验材料
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 目的基因的克隆
• 3.2.2 重组转移载体的构建
• 3.2.3 重组杆粒的获得
• 3.2.4 重组病毒的获得
• 3.2.5 重组病毒的检测
• 3.2.6 目的蛋白的表达与检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 目的基因的克隆
• 3.3.2 重组转移载体的构建
• 3.3.3 重组杆粒的鉴定
• 3.3.4 重组杆状病毒的获得
• 3.3.5 重组杆状病毒的鉴定
• 3.3.6 目的蛋白的表达与检测
• 3.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 英文缩略词表
• 致谢
• 作者简介