禾谷镰刀菌蛋白激酶基因PUF1功能验证

论文摘要

小麦赤霉病（Fusarium head blight,FHB）是由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum Schw.）引起的一种真菌病害,主要发生在温暖、潮湿地区,是一种世界性的麦类病害（Bai and Shaner 2004）。小麦赤霉病菌能够产生多种单端孢霉烯族毒素（Trichothecenes）,该毒素可使人、畜中毒,不仅危害人、畜的健康,还严重影响小麦的品质及商业价值。小麦各生育阶段均能受害,引起苗枯、茎基腐、秆腐和穗腐。生物体内普遍存在的信息转导调节方式是蛋白激酶（protein kinase,pk）和蛋白磷酸酶（protein phosphatase）催化蛋白质磷酸化与去磷酸化,这一过程几乎涉及所有的生理及病理过程。本研究选取禾谷镰刀菌基因FGSG 04053,通过tblastn在genbank中比对发现它是丝状真菌中独一无二的激酶基因（Protein kinase Unique to Filamentous fungi）,我们对它命名为PUF1。它在裂殖酵母中最同源的基因是Prp4,Prp4蛋白激酶是裂殖酵母mRNA前体完成剪切的必须因子。通过敲除禾谷镰刀菌FGSG 04053获得突变体来研究基因在禾谷镰刀菌生长、分化以及致病过程中的作用,结果如下：（1）本研究通过PEG介导原生质体转化的方法,并通过southern blot验证,得到3个PUF1基因缺失的突变体菌株。（2）PUF1基因缺失突变体菌株有严重的生长缺陷,与野生型菌株PH-1相比：菌落生长速度严重受限,没有气生菌丝,菌落生长一段时间还会突变,产生角变子（Sector）.孢子产生量下降100倍；孢子形态畸形多样,从单孢到多孢；菌落边缘生长受限导致分枝短小浓密；突变体菌株接种小麦穗不致病,接种点小麦籽粒也不含赤霉菌毒素。可见PUF1基因对病原菌的正常生长起重要作用。（3）通过构建互补载体PUF1-PHZ100,并转化突变体菌株,经PCR检测,得到5个回复突变菌株,互补转化子的表型与野生型PH-1基本一致。（4）通过构建PUF1-GFP融合载体,原生质体转化野生型菌株PH-1,得到6株PUF1-GFP融合载体成功转化的菌株,通过荧光显微镜观察PUF1-GFP融合蛋白的表达及DAPI细胞核染色确证：PUF1基因在细胞核内表达,这与裂殖酵母同源基因Prp4的功能表达是一样的,Prp4就是在细胞核内剪切mRNA的,推测PUF1基因与病原菌RNA加工过程有关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 小麦赤霉病概况
• 1.2 禾谷镰刀菌概况
• 1.2.1 禾谷镰刀菌基本生物学特性概述
• 1.2.2 禾谷镰刀菌基因功能研究概述
• 1.3 蛋白激酶研究概况
• 1.3.1 激酶基因概述
• 1.3.2 主要的蛋白激酶介绍
• 1.3.3 本研究有关的基因研究进展
• 1.4 本研究的目的意义和技术路线
• 04053基因敲除和突变体的验证'>第二章 禾谷镰刀菌FGSG₀4053基因敲除和突变体的验证
• 2.1 实验材料、仪器、试剂和培养基
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 禾谷镰刀菌Puf1基因序列分析
• 2.2.2 引物设计
• 2.2.3 CTAB法提取基因组DNA
• 2.2.4 大肠杆菌DH1OB感受态制备
• 2.2.5 质粒PCB1003的提取
• 2.2.6 重叠PCR和split PCR
• 2.2.7 琼脂糖凝胶DNA回收
• 2.2.8 PCR产物浓缩
• 2.2.9 制备原生质体及PEG介导转化
• 2.2.10 快速提取转化子DNA
• 2.2.11 PCR检测转化子
• 2.2.12 Southern blot验证突变体
• 2.3 实验结果与分析
• 04053基因序列分析'>2.3.1 FGSG₀4053基因序列分析
• 2.3.2 基因敲除引物设计
• 2.3.3 Southern blot验证结果
• 2.4 讨论
• 第三章 PUF1基因缺失突变体表型分析
• 3.1 实验材料、仪器耗材和培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 菌落形态观察和生长速率测定
• 3.2.2 产孢量测定和孢子形态观察
• 3.2.3 孢子萌发观察
• 3.2.4 菌落边缘形态观察
• 3.2.5 有性杂交实验
• 3.2.6 小麦穗侵染
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 菌落形态观察和生长速率
• 3.3.2 孢子形态、产孢量和孢子萌发
• 3.3.3 突变体菌落边缘观察
• 3.3.4 突变体有性不育
• 3.3.5 小麦穗侵染分析
• 3.4 讨论
• 第四章 PUF1基因功能回复验证
• 4.1 材料、试剂和仪器
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 试剂和仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 互补引物设计
• 4.2.2 互补载体构建
• 4.2.3 互补载体PUF1-PHZ100转化突变体菌株M15
• 4.2.4 互补转化子的筛选
• 4.2.5 互补转化子表型分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 互补载体PUF1-PHZ100的构建
• 4.3.2 互补转化子的获得
• 4.3.3 互补转化子表型分析
• 4.4 讨论
• 第五章 PUF1基因亚细胞定位
• 5.1 实验材料、试剂和仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 引物设计
• 5.2.2 亚细胞定位载体构建
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 亚细胞定位载体的构建
• 5.3.2 荧光显微镜检测基因表达部位
• 5.4 讨论
• 第六章 角变子DNA测序验证自发突变
• 6.1 材料、仪器和试剂
• 6.2 试验方法
• 6.2.1 分析与PUF1基因互作的基因并下载序列和设计引物
• 6.2.2 角变子DNA提取和基因片段扩增
• 6.2.3 角变子测序
• 6.2.4 角变子序列比对
• 6.3 结果
• 6.3.1 引物设计
• 6.3.2 角变子测序结果
• 6.4 讨论
• 第七章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介