禽传染性支气管炎病毒Sczy3株全基因组序列测定分析

禽传染性支气管炎病毒Sczy3株全基因组序列测定分析

论文摘要

鸡传染性支气管炎(IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种鸡的急性、高度接触性传染病。现在已经在全球流行蔓延,给世界家禽养殖业带来极大的经济损失。由于禽传染性支气管炎病毒(IBV)频繁的基因点突变和重组,目前已经出现了许多不同的血清型和基因型毒株,并且它们之间缺乏交叉保护性或交叉保护性低,所以分析某地区流行的IBV的基因组结构特点,有助于IB的防控。先前研究证实,近年来四川IBV分离株基因型主要是LX4即QX-like型。从S1基因进化树分析推出Sczy3分离株属于QX型,但是Sczy3基因组的其他基因片段还未被测序。本研究应用RT-PCR方法对Sczy3分离株基因组全序列进行测定,结果表明Sczy3分离株具有典型的禽状病毒基因序列特征5’Cap-1a-1b-S-3a-3b-(E)-M-5a-5b-N-3’Poly A。Sczy3分离株基因组长27695bp,含有10个开放阅读框(ORF)。Gene 1 (复制转录酶)含有两个开放阅读框ORF1a和ORF1b,分别由11856和7959个核苷酸组成,编码3951个和2652个氨基酸;Gene2(纤突蛋白基因,S)含有一个开放阅读框由3498个核苷酸组成,编码1165个氨基酸,其中S1基因编码540个氨基酸。Gene3(辅助蛋白基因)包括三个开放阅读框ORF 3a、ORF 3b和ORF3c(E),分别编码57、62和108个氨基酸;Gene 4(膜蛋白基因,M)一个开放阅读框,由678个核苷酸组成,编码225个氨基酸;Gene 5(辅助蛋白基因)含三个开放阅读框ORF 5a和ORF 5b,分别编码65和82个氨基酸;Gene 6(核衣壳蛋白基因,N)由1230个核苷酸组成,编码409个氨基酸。部分相邻基因间有重叠现象。Gene 1和Gene 2重叠110 nt, Gene 2和Gene 3重叠32 nt, Gene 3和Gene 4重叠114 nt, Gene 5和Gene 6重叠159 nt。核酸序列同源性比较表明Sczy3与参考毒株基因组序列同源性在86.1%-94.1%之间,与QX-like IBV有核苷酸同源性最高,与Mass型IBV核苷酸同源性最低。S蛋白裂解位点分析表明H-R-R-R-R不是中国分离毒株特有的裂解位点。系统进化树分析显示,与LX4型IBV亲缘关系较近,与Mass型Conn型IBV毒株亲缘关系很远。重组分析推测,Sczy3是一株嵌合IBV毒株,假定亲本毒株是LX4和H120。综上所述,本实验课题为深入研究IBV在中国的演变特征,以及IBV的反向遗传学提供参考依据,同时也丰富了冠状病毒IBV的生物信息数据库。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 英汉缩略词对照表
  • 1 前言
  • 1.1 传染性支气管炎病毒分子生物学研究进展
  • 1.1.1 IBV生物学分类地位与病毒粒子特征
  • 1.1.2 IBV基因组结构
  • 1.1.3 鸡传染性支气管炎病毒复制机制
  • 1.1.4 IBV的结构蛋白与生物学功能
  • 1.1.5 IBV的非结构蛋白与生物学功能
  • 1.1.6 IBV的非编码区与生物学功能
  • 1.2 传染性支气管炎病毒分子遗传变异研究进展
  • 1.2.1 IBV分子遗传变异的机制
  • 1.2.2 基因突变的引起遗传变异
  • 1.2.3 基因重组的引起遗传变异
  • 1.3 研究目的和意义
  • 2 试验材料
  • 2.1 毒株
  • 2.2 菌种、载体
  • 2.3 鸡胚
  • 2.4 主要试剂
  • 2.5 常用试剂配制
  • 2.6 主要仪器
  • 3 试验方法
  • 3.1 病毒培养
  • 3.2 病毒RNA提取
  • 3.3 Sczy3全基因组内部片段分段扩增
  • 3.3.1 引物设计
  • 3.3.2 RT-PCR扩增
  • 3.3.3 PCR反应
  • 3.4 RACE获取基因组末端片段
  • 3.4.1 RACE引物设计
  • 3.4.2 3’末端cDNA的扩增(3’RACE)
  • 3.4.3 5’末端cDNA的扩增(5’RACE)
  • 3.5 PCR产物回收和纯化
  • 3.6 PCR产物克隆
  • 3.6.1 E.coli DH5α感受态细胞的制备
  • 3.6.2 PCR回收产物与pMD19-T载体连接
  • 3.6.3 感受态细胞DNA转化
  • 3.6.4 重组质粒的筛选和鉴定
  • 3.6.5 阳性克隆质粒序列测定
  • 3.7 序列拼接和基因组全序列的生物信息学分析
  • 4 结果
  • 4.1 基因组内部分段RT-PCR扩增结果
  • 4.2 基因组末端序列的扩增结果
  • 4.3 序列测定和拼接
  • 4.4 Sczy3全基因组结构分析
  • 4.5 转录调控序列分析
  • 4.6 全基因组及各基因同源性分析
  • 4.6.1 5’UTR和3’UTR同源性比对结果
  • 4.6.2 Gene 1基因组同源性比对结果
  • 4.6.3 Gene 2基因组同源性比对结果
  • 4.6.4 Gene 3基因组同源性比对结果
  • 4.6.5 Gene 4基因组同源性比对结果
  • 4.6.6 Gene 5基因组同源性比对结果
  • 4.6.7 Gene 6基因组同源性比对结果
  • 4.7 系统进化树分析
  • 4.7.1 全基因系统进化树分析
  • 4.7.2 S1基因系统进化树分析
  • 4.7.2 S2基因系统进化树分析
  • 4.7.3 E基因系统进化树分析
  • 4.7.4 M基因系统进化树分析
  • 4.7.5 N基因系统进化树分析
  • 4.8 重组推测
  • 4.8.1 RDP3.44重组检测
  • 4.8.2 Simplot 3.5.1序列相似性分析
  • 4.8.3 进化树拓扑结构分析
  • 5 讨论
  • 5.1 全基因组分段扩增
  • 5.2 生物信息学分析
  • 5.3 基因重组研究
  • 6 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 相关论文文献

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