BDNF/TrkB异常表达在多发性骨髓瘤发病中的作用及机理研究

论文摘要

多发性骨髓瘤（MM）是骨髓内异常浆细胞克隆性增殖性疾病。尽管近年来MM的基础和临床研究取得了长足的进展,但是迄今为止,MM仍然是不能根治的恶性血液系统疾病。深入探讨MM发生发展的内在机制,进行特异性、靶向性治疗是血液病研究工作者面临的挑战。近年来研究表明骨髓微环境中的细胞因子及其介导的信号通路在骨髓瘤细胞的生长和存活中起重要作用,与骨髓瘤疾病的形成和恶化密切相关。前期研究发现MM患者血浆中BDNF高表达,而且BDNF表达水平与疾病进展程度相关。为了进一步研究BDNF/TrkB与MM发生发展的关系,本实验通过体外实验和临床标本的检测初步研究了BDNF及其受体TrkB和p75NTR在骨髓瘤细胞系和骨髓瘤患者细胞中的表达;进而对BDNF的体内外促血管新生作用进行了初步研究并进一步探讨BDNF与MM诱导的血管新生的关系;并且通过体内和体外实验观察BDNF对MM细胞增殖、迁移、侵袭和化疗耐药的作用;深入了解BDNF/TrkB信号参与MM的病理过程。第一部分脑源性神经营养因子及其受体在多发性骨髓瘤细胞中的表达背景和目的:脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor, BDNF）是神经营养因子家族的一员,对中枢和外周神经系统多种类型神经元的生长、发育、分化和再生具有重要作用。近年来研究发现BDNF通过激活其高亲和力TrkB受体参与多种神经系统和非神经系统实体肿瘤的发生发展,在肿瘤的发病机制中起重要作用。最新资料显示,BDNF和/或其受体TrkB异常表达也可见于血液系统肿瘤包括多发性骨髓瘤。前期实验发现MM患者血浆中BDNF高表达,而且BDNF表达水平与疾病进展程度相关。本实验通过体外实验和临床标本的检测初步研究了BDNF和其受体在骨髓瘤细胞系和骨髓瘤患者中的表达,旨在探讨BDNF/TrkB作为MM治疗的新的靶分子的可行性。方法:分离培养MM患者原代骨髓瘤细胞,RT-PCR法、Western-blot法分别检测MM细胞系（HMCLs） RPMI8226、U266、KM3细胞和原代骨髓瘤细胞BDNF及其受体TrkB和p75NTR在转录水平和蛋白水平的表达;ELISA法检测HMCLs BDNF的分泌水平;免疫组织化学染色法检测16例MM患者和9例对照骨髓活检切片中BDNF及其受体TrkB的表达。结果:RT-PCR结果表明12例MM患者原代浆细胞和HMCLs RPMI-8226、U266、KM3不仅表达BDNF mRNA,也表达其高亲和力酪氨酸激酶受体TrkB mRNA;而正常人外周血B淋巴细胞不表达BDNF和TrkB mRNA。Western-blotting分析证实HMCLs亦表达BDNF和TrkB蛋白,ELISA法检测HMCLs上清液中BDNF蛋白的基础分泌水平分别为（14.7±2.4）ng/ml、（8.2±1.3）ng/ml、（13.2±1.2）ng/ml,明显高于正常人类血浆中BDNF（2.0±0.6）ng/ml的水平。骨髓活检16例MM患者有12例瘤细胞BDNF阳性表达,15例TrkB阳性表达,表现为弥散的胞浆染色;而9例对照组正常造血细胞仅有2例和4例弱阳性表达。在HMCLs、MM患者原代浆细胞和MM患者骨髓活检切片中,RT-PCR、Western blotting和免疫组化染色均未检测到BDNF的低亲和力受体p75NTR的表达。结论:MM中存在着BDNF及其受体TrkB的异常表达,BDNF可能通过多种机制参与MM的病理生理过程,有望成为骨髓瘤治疗的新靶点。第二部分BDNF对多发性骨髓瘤血管新生作用的研究背景和目的:血管新生参与多发性骨髓瘤（MM）的病理生理过程,与MM的发生发展和预后密切相关。骨髓瘤细胞可直接分泌多种作用于血管内皮细胞的促血管新生因子,在骨髓瘤血管新生中起着重要作用。研究发现MM中存在着BDNF异常高表达,而且MM患者血清BDNF表达水平和一种重要的促血管新生因子血管内皮生长因子（VEGF）平行并有一定的相关性。最新资料显示人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人脑血管内皮细胞（HCEC）等多种内皮细胞以及新生血管平滑肌细胞均能产生BDNF,并且发现BDNF对血管内皮细胞的生长发育起着重要的支持作用,推测BDNF可能在一定程度上参与了机体新生血管的形成。因此,本实验对BDNF的体内外促血管新生作用进行了初步研究并进一步探讨人类多发性骨髓瘤细胞系BDNF的表达与MM诱导的血管新生的关系。方法:分离并培养原代HUVEC,采用四唑盐（MTT）比色法观察BDNF对HUVEC增殖的作用,用改良的Boyden小室法和体外小管形成实验等体外血管新生模型观察不同浓度BDNF对HUVEC迁移和形成血管通道的影响。体内实验采用鸡胚尿囊膜血管生成实验和小鼠Matrigel plug方法。制备KM3、RPMI-8826骨髓瘤细胞培养上清液,加或不加抗人类BDNF中和抗体,然后再分别用MTT法、改良的Boyden小室法和体外小管形成实验观察不同体积分数骨髓瘤细胞培养上清液对HUVEC增殖、迁移和分化的影响。结果:BDNF对HUVEC的增殖没有显著作用,但可明显促进HUVEC的迁移和管状结构形成。BDNF以浓度依赖性方式诱导HUVEC迁移, HUVEC的迁移指数25 ng/ml BDNF为1.24±0.18,50 ng/ml BDNF为1.56±0.23,100 ng/ml BDNF为1.89±0.29, 100 ng/ml BDNF的迁移指数与25 ng/ml VEGF相当。100 ng/ml BDNF处理后,二维基质胶中HUVEC形成完整的管状结构,小管的直径及面积均明显高于对照组（P<0.05）。BDNF亦可明显促进小鼠Matrigel plug中血管新生和鸡胚尿囊膜血管生成。另一方面,KM3、RPMI8226培养上清液均可明显促进HUVEC增殖,含50.0%KM3培养上清液组和完全KM3培养上清液组HUVEC数均明显高于对照组（P<0.05）,抗人类BDNF中和抗体可部分抑制其促增殖活性;MM细胞系培养上清液对HUVEC的迁移和分化亦有明显的促进作用,含50.0%KM3培养上清液组HUVEC迁移指数为1.85±0.23（P<0.05）,完全KM3培养上清液组HUVEC迁移指数为2.16±0.29（P<0.05）,并可明显促进基质胶中网状毛细血管形成（P<0.01）,抗BDNF中和抗体可明显抑制其作用。结论:BDNF在体内外均具有明显的促血管新生作用,可能为一种新的促血管新生因子;骨髓瘤细胞异常表达和分泌的BDNF可能参与骨髓瘤细胞诱导的血管新生。第三部分BDNF激活TrkB受体促进骨髓瘤细胞增殖和迁移的实验研究背景和目的:研究表明MM的转化主要发生在骨髓,骨髓微环境中的细胞因子及其介导的信号通路在骨髓瘤细胞的生长和存活中起重要作用,与骨髓瘤疾病的形成和恶化密切相关。MM中存在着BDNF及其高亲和力酪氨酸激酶受体TrkB的异常表达,近年来研究发现BDNF/TrkB在调控细胞增殖、生长、迁移和侵袭过程中起重要作用,参与多种恶性肿瘤的发生发展,为此,本实验对BDNF对MM细胞增殖迁移和化疗保护的作用进行了初步研究,旨在探讨BDNF/TrkB与MM发生发展的关系。方法:分离培养MM患者原代骨髓瘤细胞,采用台盼蓝拒染法检测BDNF对HMCLs（RPMI 8226、U266、KM3）和原代MM细胞的存活促进作用,[3H]脱氧胸苷（3H-dTR）掺入法测定BDNF对MM细胞增殖的影响,用改良的Boyden小室法观察BDNF对骨髓瘤细胞迁移和侵袭的影响,用MTT比色法观察BDNF对马法兰和长春新碱细胞毒作用的影响,用Western blotting检测BDNF对MM细胞TrkB受体磷酸化的影响。动物模型观察BDNF对肿瘤生长和存活时间的影响。结果:（1）BDNF以浓度依赖性方式促进RPMI 8226、U266、KM3细胞和原代MM细胞的存活和增殖。（2）BDNF可促进MM细胞的迁移和侵袭,BDNF对RPMI8226及KM3细胞具有明显的迁移促进作用,12.5 ng/ml～200 ng/ml BDNF作用后迁移指数分别为1.63～3.11和1.92～3.76,其最大迁移活性分别在50 ng/ml （P < 0.05）和25 ng/ml （P < 0.01）时达到;而BDNF对U266的迁移仅有中等强度的促进作用,迁移指数为1.2～2.1。（3） BDNF可明显降低马法兰和长春新碱的细胞毒性,50 ng/ml BDNF作用后,马法兰和长春新碱的EC50分别为无BDNF作用时的2倍和3倍。（4）BDNF可明显促进异种移植的MM裸鼠模型中肿瘤的生长,增加肿块的体积和重量,缩短裸鼠的生存时间。（5）MM细胞中异常表达的TrkB受体是BDNF的功能性受体,外源性BDNF作用后,MM细胞TrkB磷酸化水平明显增加,并且Trk抑制剂K252a可明显抑制BDNF诱导的MM细胞迁移。结论:外源性BDNF可磷酸化激活MM细胞表面TrkB受体,促进骨髓瘤细胞的增殖、存活、迁移并参与骨髓瘤细胞的化疗耐药,在MM的病理生理进程中起重要作用。

论文目录

• 一 前言
• 二 英文缩写及中英文对照
• 三 论文摘要
• 中文摘要
• 英文摘要
• 四 论文正文 BDNF/TrkB 异常表达在多发性骨髓瘤发病中的作用及机理研究
• 第一部分 脑源性神经营养因子（BDNF）及其受体在多发性骨髓瘤细胞中的表达
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 BDNF 对多发性骨髓瘤血管新生作用的研究
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 BDNF 激活TrkB 受体促进骨髓瘤细胞增殖和迁移的实验研究
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 五 全文总结
• 六 参考文献
• 七 综述
• 八 附录研究生学习期间发表的文章
• 九 致谢