论文摘要
子宫内膜异位症（EMs）是妇科的常见病、多发病,约有10%15%的育龄妇女罹患此病。EMs的发病机制尚未阐明,现有的手术治疗及药物治疗方案均难以达到满意的效果。因此进一步探讨EMs的发病机制及寻求新的治疗靶点尤为必要。EMs具有类似肿瘤的粘附、侵袭、转移等生物学行为,二者在发病机制上可能具有一定的相似性,而间隙连接细胞间通讯（GJIC）功能缺陷或低下是肿瘤的普遍特征,因此我们推测在EMs的发病过程中可能也存在GJIC功能的异常。GJIC是相邻细胞间传递信息的主要方式,它在维持机体组织内环境的稳定、调节正常细胞的生长等方面极为重要。细胞GJIC功能受其结构单位连接子的调控,圆柱状的连接子含有一个亲水通道,它允许离子（Na+、K+、Ca2+等）及分子量小于1000的小分子（cAMP、cGMP、IP3等）自由通过。每个连接子由6个蛋白亚单位（Cx）组成,啮齿动物和人的子宫内膜中表达的连接蛋白主要有Cx43、Cx32、Cx26三种。在EMs的发病过程中,间质细胞起着重要的主导作用,正常间质细胞具有完善的GJIC功能,并且能通过间隙连接影响上皮细胞的GJIC功能状态,故EMs内膜间质细胞的GJIC功能理应受到更多的关注。研究发现全反式维甲酸（ATRA）具有上调肿瘤细胞Cx表达和GJIC功能的作用,从而诱导肿瘤细胞恢复良性表型。ATRA对正常子宫内膜间质细胞也有类似的上调作用,但尚不清楚ATRA是否能调节EMs内膜间质细胞Cx表达及GJIC功能。探讨这些问题将为ATRA尝试用于EMs的治疗提供理论依据。本研究分为三个部分:（1）建立EMs在位、异位和正常内膜的间质细胞和上皮细胞体外培养模型;（2）通过体外培养的内膜细胞分析EMs内膜间质细胞Cx表达及GJIC功能的差异;采用反义寡聚核苷酸技术抑制正常内膜间质细胞Cx的表达,了解GJIC功能抑制后,正常内膜间质细胞的生长、粘附及侵袭能力是否增强,以此全面分析间质细胞的GJIC功能在EMs发病中的作用;（3）探讨ATRA对EMs在位及异位内膜间质细胞GJIC功能的调节作用及相关机制,以初步解答ATRA用于EMs治疗的可能性。第一部分EMs在位、异位及正常内膜间质细胞和上皮细胞的体外培养目的:探索一种获得高产率及高纯度子宫内膜间质细胞和上皮细胞的分离培养方法,同时建立EMs在位、异位及正常内膜细胞的体外培养模型,并尝试细胞的冻存与复苏,为后续实验奠定基础。方法:选取重庆医科大学附属第一医院妇产科2006年2月2007年1月住院行手术治疗的内异症患者41例,其中合并单侧或双侧卵巢巧克力囊肿24例;取同期因子宫肌瘤行子宫全切术的患者30例作对照。刮取靠近子宫底部的内膜组织或剥取卵巢巧克力囊肿的内壁。借鉴传统的细胞分离方法并加以改良,采用机械碎化、多种酶联合消化、细胞滤网分选、不同细胞贴壁时间差而将间质与上皮细胞分离纯化。结果:间质细胞与上皮细胞同时成功培养率分别为:异位内膜组33.3%（8/24）、EMs在位内膜组92.7%（38/41）、对照组93.3%（28/30）,两组在位内膜间质细胞纯度达98%,异位内膜间质细胞纯度为95%;两组在位内膜上皮细胞纯度达95%,异位内膜上皮细胞纯度为92%。上皮细胞和间质细胞均能成功地冻存与复苏。结论:改良的分离方法可提高间质细胞与上皮细胞的产率与活力,而且两种细胞的纯度较高,能完全满足后续实验的要求。第二部分子宫内膜间质细胞的Cx表达及GJIC功能在EMs发病中的意义目的:找出EMs内膜间质细胞Cx表达及GJIC功能的差异,探讨间质细胞GJIC功能异常在EMs发病过程中的意义。方法:（1）以免疫荧光法检测EMs异位、在位内膜以及正常子宫内膜间质细胞和上皮细胞Cx43、Cx32、Cx26的表达。（2）采用荧光漂白后恢复技术分析三组内膜间质细胞和上皮细胞的GJIC功能,并探讨共培养体系中EMs内膜间质细胞对不同上皮细胞GJIC功能的调节作用。（3）通过Lipo介导下的反义寡聚核苷酸技术（ASODNs）,特异性下调正常间质内膜细胞中Cx43蛋白表达,分析间质细胞的生长、粘附及侵袭能力的改变。结果:Cx43在对照组间质细胞、EMs在位内膜间质细胞、异位内膜间质细胞中表达依次降低;Cx32、Cx26仅表达于两组在位内膜的上皮细胞中,且两组间的表达量相同;异位内膜上皮细胞出现Cx43的异常表达。对照组、EMs在位内膜及异位内膜三组的上皮细胞GJIC功能无明显差异,其间质细胞GJIC功能则按对照组→EMs在位组→EMs异位组依次减弱。EMs在位、异位内膜间质细胞对不同上皮细胞GJIC的调节作用均较对照组减弱。间质细胞的GJIC功能以及对上皮细胞的调节能力与其Cx43的表达量密切相关。ASODNs+Lipo的转染效率较高,对目的蛋白Cx43的抑制作用明显,撤除ASODNs+Lipo后,抑制效果至少可持续48h以上。GJIC功能被抑制后,正常间质细胞表现出生长加速,粘附、侵袭能力增强。结论:间质细胞Cx43表达降低、GJIC功能减弱与EMs发病关系密切,间质细胞的Cx43或GJIC功能可能是EMs潜在的治疗靶点。第三部分ATRA对EMs内膜间质细胞Cx43表达、GJIC功能的调节作用及相关机制目的:研究全反式维甲酸（ATRA）对EMs在位及异位内膜间质细胞Cx43表达和GJIC功能的调节作用及其相关机制,初步探讨ATRA用于EMs治疗的可能性。方法:（1）采用不同浓度的ATRA处理EMs在位及异位内膜间质细胞,并检测其GJIC功能及Cx43 mRNA和蛋白的表达。（2）引入雌激素受体（ER）拮抗剂ICI 182 780,分析ATRA的作用与ER的关系。（3）引入TPA（佛波酯,系Cx磷酸化诱导剂）,分析ATRA的作用与Cx43蛋白磷酸化状态的关系。结果:ATRA浓度为1μmol/L和10μmol/L时,均能有效上调EMs内膜间质细胞的GJIC功能,但上调作用至72h以后不再继续增加;ATRA浓度为0.1μmol/L时则没有上调作用。1μmol/L ATRA能诱导间质细胞Cx43 mRNA及蛋白的表达。不同浓度的ICI 182 780均不影响ATRA对间质细胞GJIC功能的上调作用。TPA能抑制ATRA对间质细胞GJIC功能的上调作用。结论:ATRA可上调EMs在位及异位内膜间质细胞的GJIC功能,且上调效果与ATRA的作用时间及浓度有关; ATRA能从基因和翻译水平促进Cx43的表达,诱导或维持Cx43蛋白的去磷酸化形式,从而上调EMs内膜间质细胞的GJIC功能。
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