论文摘要
研究目的：糖尿病对记忆功能的影响是重要的医学问题。本论文以SD大鼠为研究对象,在学习和记忆的行为学层次及学习记忆关键脑区（海马PP-DG通路）的突触可塑性层次上,研究糖尿病降低大鼠学习记忆功能的突触可塑性机制。从大鼠空间记忆能力的行为学特征,大鼠海马前穿通纤维-齿状回（PP-DG）通路的突触可塑性变化,包括长时程增强（long-term Potentiation, LTP）、长时程抑制（long-term Depression, LTD）及双脉冲易化（paired pulse facility, PPF）等,探讨糖尿病大鼠空间记忆能力的降低及其突触可塑性机制。研究方法：1.实验动物：SD大鼠70只,起始体重（180±20）g。2.把SD大鼠随机分为3组：对照组（Control）, STZ诱导糖尿病组和高脂饲料喂养联合STZ诱导糖尿病组。应用链脲佐菌素（STZ）一次性腹腔注射和联合高脂饲料喂养的方法分别制备模拟类似1型和2型糖尿病大鼠模型。其中对照组10只,2个模型组各30只。3.将3组大鼠分别进行Morris水迷宫学习记忆行为学测试,分别研究两种造模方法导致的糖尿病对大鼠空间记忆能力和空间关联记忆能力的影响。（1）定位航行实验：3组大鼠连续训练4天。每个时间段大鼠分别从水迷宫的第Ⅰ、第Ⅱ、第Ⅲ坐标象限内标定的入水点入水,学习寻找没于水面以下的平台。（2）空间探索实验：撤去平台,将大鼠从已训练过的第工象限入水点将3组大鼠逐个放入水中,记录其在120s内运动轨迹及相应参数。（3）空间关联记忆能力实验：撤去平台,从没有训练过的第Ⅳ象限的入水点分别将3组大鼠逐个放入水中,记录其在120s内运动轨迹及相应参数。4.水迷宫测试后,分别从2个糖尿病模型组中选出空间记忆能力较差的15只大鼠,和对照组同时进行海马PP-DG通路的LTP、LTD、PPF测试实验。（1）大鼠用乌拉坦麻醉后头部固定于立体定位仪。将刺激电极置于大鼠内嗅区前穿通纤维（PP）,记录电极置于海马齿状回（DG）。刺激信号从刺激器输出,经隔离器到达刺激电极,记录电极记录细胞外场兴奋性突触后电位（fEPSP）及突触后群峰电位（PPS）,信号经过膜片钳放大器。测定输入／输出（I/O）曲线。（2）配对易化（PPF）记录：选择诱发50%最大群峰电位（PS）幅值的刺激强度为条件刺激（CS）强度。PS稳定20 min后,用双脉冲进行刺激,间隔30-100ms,波宽150μs,频率0.5 Hz,刺激强度为条件刺激强度。每个间隔记录5次,计算PS2与PSl比值。（3）长时程增强（LTP）记录：PS稳定后,CS刺激并记录30min,作为基线（baseline）。LTP实验时,进行高频刺激（high frequency stimulus, HFS）,20个200Hz的脉冲为一组,间隔2s,共10组,强度为诱发75%最大PS幅值的刺激强度。HFS后,改用条件刺激并记录60min。（4）长时程抑制（LTD）记录：PS稳定后,CS刺激并记录30min,作为基线（baseline）。LTD实验时,进行低频刺激（low frequency stimulus, LFS）,900个1 Hz的串刺激,每个串为250 Hz的5个脉冲,刺激强度为CS强度。LFS后,改用条件刺激并记录60min。5.分析讨论糖尿病大鼠学习记忆功能的降低及其突触可塑性机制。研究结果：1.糖尿病大鼠模型的验证：造模后的第3、7、14、28天检测两个糖尿病模型组的空腹血糖值,均大于16.7mmol/L, STZ诱导糖尿病组28天时血糖平均值为26.40±3.55（n=30）,高脂喂养联合STZ诱导组为24.85±5.34（n=30）。2. Morris水迷宫学习记忆能力行为学：（1）糖尿病造模1个月后,糖尿病组大鼠和正常对照组的空间记忆和空间关联记忆能力的比较没有统计学差异。（2）糖尿病造模3个月后,在定位航行实验中,两个糖尿病组大鼠的逃避潜伏期都比对照组时间长,Control组第4天的平均值为7.90±3.58（n=30）,STZ诱导组为19.02±2.15（n=30）,高脂喂养联合STZ诱导组为20.69±3.02（n=30）,模型组与对照组具有统计学差异（P<0.05）。实验第2天开始,对照组逃避潜伏期的下降趋势明显,而糖尿病组下降缓慢。（3）糖尿病造模3个月后,在空间探索实验中,从训练过的Ⅰ象限入水时,两个糖尿病模型组平台象限游泳时间短,第1环点数和总得分低,STZ诱导组这三项参数值分别为43.76±10.38（n=30）,5.33±2.27（n=30）,2372.11±187.23（n=30）;高脂喂养联合STZ诱导组三项参数值分别为40.88±14.56（n=30）, 4.85±2.86（n=30）,2081.67±195.18（n=30）.而Control组三项参数分别为：69.77±1236（n=30）,11.36±2.78（n=30）,3172.74±250.80（n=30）；模型组与对照组的差异具有统计意义（p<0.05）。从未训练的Ⅳ象限入水时,平台象限游泳时间、第1环点数和总得分为：STZ诱导组38.82±9.63（n=30）,4.86±2.15（n=30）,2015.98±206.33（n=30）；高脂喂养联合STZ诱导组40.67±11.95（n=30）,5.31±2.26（n=30）,2206.85±157.40（n=30）；Control组62.64±10.78（n=30）,10.57±2.96（n=30）,2912.63±191.39（n=30）.糖尿病模型组的参数值也均低于正常对照组,具有统计学差异（P<0.05）,而且STZ诱导的糖尿病组的总得分比高脂喂养联合STZ诱导的糖尿病组更低一些。3.海马PP-DG通路的突触可塑性（1）I/O曲线波形：对照组50%最大反应波形对应强度为0.35mA,STZ诱导组50%最大反应波形对应强度为0.45mA,高脂喂养联合STZ诱导组50%最大反应波形对应强度为0.41mA。糖尿病模型组I/O曲线均整体向下、向右移动,并且STZ诱导组的I/O曲线与高脂喂养联合STZ诱导组相比,和对照组的距离更远。（2）配对易化（PPF）:Control组增强起始点为35ms,高脂喂养联合STZ诱导组为37ms,STZ诱导组为42ms。3组大鼠的易化强度分别为：Control组（204.80±14.57）％（n=8）,高脂喂养联合STZ组（181.79±13.81）％（n=7）,STZ诱导组（172.68±15.02）％（n=7）.在脉冲间隔30-100ms内,双脉冲易化宽度分别为Control组65ms,高脂喂养联合STZ组63ms,STZ诱导组58ms。可以看出,糖尿病模型组较正常对照组双脉冲易化强度降低,易化宽度减小,具有统计学意义（p<0.05）。STZ诱导组的双脉冲易化强度更低一些。（3）LTP：高频刺激后60min时,Control组与高脂喂养联合STZ组、STZ诱导组的PS幅值分别为条件刺激PS幅值的（258.93±22.45）%（n=7）,（203.67±19.86）％（n=6）,（160.12±17.91）％（n=6）:高脂喂养联合STZ组LTP比Control组降低55.26%,STZ诱导组LTP比Control组降低98.81%,模型组与对照有统计学意义（p<0.05）,并且STZ诱导糖尿病组降低得更多。（4）LTD：低频刺激后60 min时,Control组与高脂喂养联合STZ组、STZ诱导组的PS幅值分别为条件刺激PS幅值的（106.35±3.51）%（n=6）, （81.92±9.96）％（n=5）,（67.73±4.35）%（n=5）。结果显示糖尿病模型组LTD易化,模型组与对照组有显著差异（p<0.05）。高脂喂养联合STZ组PS幅值较Control组减幅为24.43%, STZ诱导组的PS幅值比Control组减少38.62%,可见STZ诱导的糖尿病组LTD易化的幅度比高脂喂养联合STZ诱导糖尿病组更大。（5）突触可塑性范围Control组为152.58%（n=6）,高脂喂养联合STZ组的突触可塑性范围是121.75%（n=5）, STZ诱导组突触可塑性范围为92.39%（n=5）。由此可见,糖尿病降低了大鼠海马PP-DG通路的突触可塑性范围,其中STZ诱导的糖尿病组大鼠突触可塑性遭到的破坏更大,所以突触可塑性的范围更小研究结论：本论文研究糖尿病降低大鼠学习记忆功能的突触可塑性机制。通过大鼠水迷宫空间记忆能力的行为学和海马PP-DG通路的突触可塑性研究,得出主要结论如下：1.糖尿病对大鼠空间学习记忆行为学的影响（1）通过Morris水迷宫行为学实验说明,经过一定时间后,糖尿病会导致大鼠发生空间记忆能力和空间关联记忆能力的下降。（2）相比高脂喂养联合STZ诱导的糖尿病大鼠来说,STZ诱导的糖尿病组大鼠空间关联记忆能力可能受到的影响更大。2.糖尿病大鼠学习记忆下降的突触可塑性机制（1）患糖尿病后,大鼠海马PP-DG区的I/O曲线下移,相同强度引起的突触后反应波形PS幅值减小,说明糖尿病使得突触传递效能降低。（2）患糖尿病后,大鼠海马双脉冲易化强度受到显著抑制,双脉冲易化的间隔范围缩短。提示糖尿病影响大鼠海马PP-DG短时程突触可塑性可能是通过抑制突触前神经递质的释放来实现的。（3）STZ诱导和高脂喂养联合STZ诱导的糖尿病大鼠海马LTP的形成被显著抑制,海马LTD现象易化,从而减小了突触可塑性范围,可见糖尿病降低了大鼠海马PP-DG通路的长时程突触可塑性。（4）相比高脂喂养联合STZ诱导的糖尿病大鼠来说,STZ诱导的糖尿病大鼠双脉冲易化强度更低,LTP受抑制更大,LTD易化的幅度更大,突触可塑性的范围更小,对海马突触可塑性的破坏更严重。
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