对导入nodD-lba基因的大豆根瘤菌工程菌株的研究

论文摘要

在自然环境中,植物需要的氮的主要来源是生物固氮的作用,对于农业生产来说也是比较重要的。结瘤相关基因在根瘤菌与植物的共生过程中起到重要的作用,其中之一的nodD基因属于调节基因,它能够编码出NodD蛋白来调节其它nod结构基因表达。NodD蛋白的功能是调控某些细菌在与真核生物进行相互作用时某些行驶功能作用的基因的表达。而大豆血红蛋白是大豆根瘤中所特有的,在类菌体的周围起氧缓冲的作用,能够阻止过多的游离氧接触固氮酶,使固氮酶免受氧的损害,从而保持高效的固氮活性。大豆血红蛋白是由四个相对应的基因所编码,分别是lba、lbc1、lbc2、lbc3。实验室的前期研究表明,导入nodD基因和lba基因的大豆根瘤菌工程菌株能够明显提高大豆根瘤的固氮酶活性。本研究将nodD基因和lba基因串联导入大豆根瘤菌中研究其共同作用是否能明显提高固氮作用。本研究利用PCR技术,以本实验室前期构建的大豆根瘤菌质粒DNA为模板,将结瘤相关基因nodD和固氮相关基因lba以串联的方式连入带有lac启动子和T7终止子的质粒载体pET-P1ac中,获得目的片段Plac-nodD-lba后将其连入带有luxAB发光酶基因的原核表达载体pTR102中,构建原核表达载体pTR-Plac-nodD-lba。将此表达载体通过三亲本杂交方法转化费氏中华根瘤菌和土著大豆根瘤菌,成功构建出转基因大豆根瘤菌工程菌株SF（pTR-Plac-nodD-lba）、SFH（pTR-Plac-nodD-lba）。 Western Blot鉴定结果证明导入的目的基因可以正常表达,植物实验测定结果表明转基因工程菌株在提高大豆植株的株高、鲜重干重、结瘤数、固氮酶活性以及产量上效果优于未接菌和接入原始菌株及转空载体菌株,其中转串联基因的工程菌株与转单个基因的工程菌株相比固氮酶活性提高4%-7%,大豆产量提高17%-22%。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 生物固氮及其机理
• 1.1.1 固氮微生物的种类
• 1.1.2 生物固氮的类型
• 1.2.结瘤因子及其生理作用
• 1.3 大豆血红蛋白的性质与功能
• 1.4 本研究的目的及意义
• 1.5 本研究的技术路线
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 质粒载体
• 2.1.4 实验试剂与仪器
• 2.1.4.1 实验试剂
• 2.1.4.2 实验仪器
• 2.1.5 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 目的基因的获得
• 2.2.2 原核表达载体的构建
• 2.2.3 转基因工程菌株的构建
• 2.2.4 转基因工程菌株的发光酶活性检测
• 2.2.5 转基因工程菌株的Western Blot鉴定
• 2.2.6 质粒的遗传稳定性检测
• 2.2.7 大豆生物量及固氮酶活性测定
• 第3章 结果与分析
• 3.1 nodD基因和lba基因的扩增及生物信息学分析
• 3.1.1 nodD基因和lba基因的PCR扩增
• 3.1.2 目的基因的生物信息学分析
• 3.2 原核表达载体的构建
• lac-nodD的构建'>3.2.1 重组载体pET-P_lac-nodD的构建
• lac-nodD-lba的构建'>3.2.2 重组载体pTR-P_lac-nodD-lba的构建
• lac-nodD-lba的构建'>3.2.3 原核表达载体pTR-P_lac-nodD-lba的构建
• 3.3 转基因大豆根瘤菌工程菌株的检测
• 3.3.1 转基因大豆根瘤菌工程菌株的筛选
• 3.3.2 转基因大豆根瘤菌工程菌株的发光酶活性检测
• 3.3.3 转基因大豆根瘤菌工程菌株的Western Blot检测
• 3.3.4 转基因大豆根瘤菌工程菌株质粒遗传稳定性测定
• 3.4 大豆生物量及固氮酶活性测定结果
• 3.4.1 转化费氏中华根瘤菌工程菌株的测定结果
• 3.4.2 转化土著大豆根瘤菌的工程菌株的测定结果
• 第4章 讨论
• 4.1 表达载体的选择与构建
• 4.2 不同转基因工程菌株对大豆固氮酶活性的影响
• 4.3 转基因工程菌株的蛋白鉴定
• 4.4 下一步实验设想
• 第5章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文